| 缩略语 | 第3-5页 |
| 摘要 | 第5-7页 |
| ABSTRACT | 第7-8页 |
| 目录 | 第9-13页 |
| 第一章 前言 | 第13-27页 |
| 1.1 唾液酸 | 第13-19页 |
| 1.1.1 唾液酸的结构与性质 | 第13-15页 |
| 1.1.2 唾液酸的生物学功能及应用 | 第15-16页 |
| 1.1.3 唾液酸的生产方法 | 第16-19页 |
| 1.2 聚唾液酸 | 第19-23页 |
| 1.2.1 聚唾液酸的结构与性质 | 第19-20页 |
| 1.2.2 聚唾液酸的生物学功能及应用 | 第20-21页 |
| 1.2.3 微生物发酵生产聚唾液酸 | 第21-23页 |
| 1.3 聚唾液酸代谢途径的强化 | 第23-25页 |
| 1.4 主要研究内容和意义 | 第25-27页 |
| 1.4.1 主要研究内容 | 第25-26页 |
| 1.4.2 研究意义 | 第26-27页 |
| 第二章 全细胞催化生产N-乙酰神经氨酸的条件优化 | 第27-45页 |
| 2.1 材料、仪器与试剂 | 第27-30页 |
| 2.1.1 材料 | 第27页 |
| 2.1.2 主要仪器 | 第27-28页 |
| 2.1.3 培养基和溶液 | 第28-29页 |
| 2.1.4 生化试剂 | 第29-30页 |
| 2.2 方法与步骤 | 第30-35页 |
| 2.2.1 重组蛋白的自诱导表达 | 第31页 |
| 2.2.2 表达蛋白的SDS-PAGE分析 | 第31-32页 |
| 2.2.3 生物转化 | 第32页 |
| 2.2.4 工程菌E.coli △nanTEK/pNA表达条件的优化 | 第32-33页 |
| 2.2.5 工程菌E.coli △nanTEK/pNA转化条件的优化 | 第33-34页 |
| 2.2.6 分析测定方法 | 第34-35页 |
| 2.3 结果 | 第35-43页 |
| 2.3.1 诱导温度的影响 | 第35-36页 |
| 2.3.2 诱导时间的影响 | 第36-37页 |
| 2.3.3 转化温度的影响 | 第37-38页 |
| 2.3.4 转化时间的影响 | 第38-39页 |
| 2.3.5 转化底物的量的影响 | 第39-40页 |
| 2.3.6 表面活性剂Triton X-100对生物转化的影响 | 第40-41页 |
| 2.3.7 转化体系中菌体OD_(600)对生物转化的影响 | 第41-42页 |
| 2.3.8 E.coli △nanTEK/pNA菌体的重复使用 | 第42-43页 |
| 2.4 讨论 | 第43页 |
| 2.4.1 生物转化时间的影响 | 第43页 |
| 2.4.2 底物浓度的影响 | 第43页 |
| 2.4.3 表面活性剂的影响 | 第43页 |
| 2.5 小结 | 第43-45页 |
| 第三章 全细胞催化生产Neu5Ac途径中丙酮酸代谢旁路的敲除 | 第45-59页 |
| 3.1 材料、仪器与试剂 | 第46-48页 |
| 3.1.1 材料 | 第46页 |
| 3.1.2 主要仪器 | 第46-47页 |
| 3.1.3 培养基和溶液 | 第47页 |
| 3.1.4 生化试剂 | 第47-48页 |
| 3.2 方法与步骤 | 第48-52页 |
| 3.2.1 敲除株鉴定引物设计 | 第48页 |
| 3.2.2 各敲除株的PCR鉴定 | 第48-49页 |
| 3.2.3 敲除株化转感受态细胞的制备 | 第49页 |
| 3.2.4 质粒pSaNA的转化 | 第49-50页 |
| 3.2.5 敲除株抗性基因kan的消除 | 第50页 |
| 3.2.6 P1噬菌体转染性状整合 | 第50-51页 |
| 3.2.7 生物转化 | 第51-52页 |
| 3.2.8 分析方法 | 第52页 |
| 3.3 结果 | 第52-57页 |
| 3.3.1 各敲除株的鉴定结果 | 第52页 |
| 3.3.2 单基因敲除株的生长曲线 | 第52-53页 |
| 3.3.3 单基因敲除株的生物转化结果 | 第53-54页 |
| 3.3.4 E.coli △plfB的kan消除 | 第54-55页 |
| 3.3.5 组合敲除 | 第55页 |
| 3.3.6 组合敲除株的生长曲线 | 第55-56页 |
| 3.3.7 组合敲除株E.coli △BA的转化 | 第56-57页 |
| 3.4 讨论 | 第57-58页 |
| 3.5 小结 | 第58-59页 |
| 第四章 乙酰基转移酶、CMP-Neu5Ac合成酶和唾液酸转移酶的克隆与表达及PSA的生产 | 第59-83页 |
| 4.1 材料、仪器与试剂 | 第59-61页 |
| 4.1.1 材料 | 第59页 |
| 4.1.2 主要仪器 | 第59-60页 |
| 4.1.3 培养基和溶液 | 第60-61页 |
| 4.1.4 生化试剂 | 第61页 |
| 4.2 方法与步骤 | 第61-69页 |
| 4.2.1 引物设计 | 第61-63页 |
| 4.2.2 细菌基因组DNA的提取 | 第63页 |
| 4.2.3 乙酰基转移酶、CMP-Neu5Ac合成酶和唾液酸转移酶基因扩增 | 第63-64页 |
| 4.2.4 DNA产物纯化试剂盒纯化PCR产物 | 第64-65页 |
| 4.2.5 质粒的提取 | 第65页 |
| 4.2.6 质粒pRX4和目的片段的双酶切 | 第65-66页 |
| 4.2.7 目的片段的回收 | 第66页 |
| 4.2.8 原核表达载体pRX4与目的片段连接 | 第66页 |
| 4.2.9 E.coli DH5a化转感受态细胞的制备 | 第66-67页 |
| 4.2.10 连接产物的转化 | 第67页 |
| 4.2.11 阳性克隆子的筛选与鉴定 | 第67页 |
| 4.2.12 重组质粒转化至表达宿主菌 | 第67-68页 |
| 4.2.13 表达蛋白的SDS-PAGE分析 | 第68页 |
| 4.2.14 微生物发酵(1)生产PSA | 第68页 |
| 4.2.15 微生物发酵(2)生产PSA | 第68页 |
| 4.2.16 间苯二酚反应分析PSA产量 | 第68-69页 |
| 4.3 结果与分析 | 第69-80页 |
| 4.3.1 neuD,neuA和neuS的单独表达 | 第69-73页 |
| 4.3.2 neuD、neuA和neuS的共表达 | 第73-74页 |
| 4.3.3 菌株E.coli SA9/DAS发酵生产PSA | 第74-75页 |
| 4.3.4 菌株E.coli SA9/pbla-DAS和E.coli SA9/pRFlap-DAS发酵生产PSA | 第75-76页 |
| 4.3.5 优化PSA合成代谢途径 | 第76-77页 |
| 4.3.6 neuD,neuA和neuS对PSA发酵的影响 | 第77-80页 |
| 4.4 讨论 | 第80-82页 |
| 4.4.1 稀有密码子对蛋白表达的影响 | 第80页 |
| 4.4.2 强化聚唾液酸的合成途径 | 第80-81页 |
| 4.4.3 优化生产工艺 | 第81页 |
| 4.4.4 改造聚唾液酸的合成途径 | 第81-82页 |
| 4.5 小结 | 第82-83页 |
| 第五章 结论与展望 | 第83-85页 |
| 5.1 结论 | 第83-84页 |
| 5.2 进一步工作的方向 | 第84-85页 |
| 致谢 | 第85-86页 |
| 参考文献 | 第86-95页 |
| 攻读学位期间的研究成果 | 第95页 |
| 个人简历 | 第95页 |
