| 摘要 | 第7-9页 |
| ABSTRACT | 第9-10页 |
| 第一章 文献综述 | 第11-31页 |
| 1 禽流感概况 | 第11-17页 |
| 1.1 禽流感病毒的分子生物学特征 | 第11-13页 |
| 1.1.1 禽流感病毒的结构 | 第11-12页 |
| 1.1.2 禽流感病毒的基因组结构 | 第12页 |
| 1.1.3 禽流感病毒的蛋白结构与功能 | 第12-13页 |
| 1.2 禽流感病毒的分类 | 第13页 |
| 1.3 禽流感病毒的致病机理 | 第13-14页 |
| 1.4 禽流感疫苗的研究进展 | 第14-17页 |
| 1.4.1 灭活全病毒疫苗 | 第14页 |
| 1.4.2 亚单位疫苗 | 第14-15页 |
| 1.4.3 核酸疫苗 | 第15页 |
| 1.4.4 病毒活载体疫苗 | 第15-17页 |
| 2 火鸡疱疹病毒概况 | 第17-24页 |
| 2.1 火鸡疱疹病毒的增殖 | 第17-18页 |
| 2.2 火鸡疱疹病毒的基因结构 | 第18页 |
| 2.3 火鸡疱疹病毒载体的研究进展 | 第18-19页 |
| 2.4 重组火鸡疱疹病毒构建的方法和原理 | 第19页 |
| 2.5 火鸡疱疹病毒细菌人工染色体 | 第19-24页 |
| 2.5.1 BAC载体系统的简介 | 第19页 |
| 2.5.2 BAC载体系统的研究背景 | 第19-20页 |
| 2.5.3 BAC载体系统的优点 | 第20页 |
| 2.5.4 BAC分子克隆化病毒 | 第20-21页 |
| 2.5.5 细菌人工染色体修饰技术 | 第21-24页 |
| 2.5.5.1 Red/ET介导的同源重组 | 第21-22页 |
| 2.5.5.2 RecA蛋白介导的同源重组 | 第22页 |
| 2.5.5.3 Cre/Loxp介导的同源重组 | 第22页 |
| 2.5.5.4 火鸡疱疹病毒BAC及其应用 | 第22-24页 |
| 参考文献 | 第24-31页 |
| 第二章 表达H5N1亚型禽流感病毒HA重组火鸡疱疹病毒的构建 | 第31-53页 |
| 1 材料 | 第31-32页 |
| 1.1 病毒、质粒与细胞 | 第31页 |
| 1.2 主要试剂 | 第31-32页 |
| 1.3 主要仪器设备 | 第32页 |
| 2 试验方法 | 第32-44页 |
| 2.1 HA表达盒的构建与验证 | 第32-38页 |
| 2.1.1 引物设计与合成 | 第32-33页 |
| 2.1.3 重组质粒PT-HA转化DH5α | 第33页 |
| 2.1.4 PT-HA质粒的提取 | 第33-34页 |
| 2.1.5 质粒pT-PHAE的构建 | 第34-35页 |
| 2.1.6 HA基因与T-PE连接转化 | 第35-36页 |
| 2.1.7 质粒PT-PHAE酶切鉴定 | 第36页 |
| 2.1.8 转移载体质粒PT-PHAE-Kan~+的构建 | 第36-38页 |
| 2.2 重组BAC(pBAC~(HVT-HA) KAN~+)的构建与验证 | 第38-42页 |
| 2.2.1 感受态细胞HVT GS1783的制备 | 第38-39页 |
| 2.2.2 HA表达盒添加同源臂 | 第39-40页 |
| 2.2.3 电转重组获得重组BAC(BAC~(-HVT-HA) KAN~+) | 第40页 |
| 2.2.4 重组BAC质粒(pBAC~(-HVT-HA) KAN~+)的提取 | 第40页 |
| 2.2.5 重组BAC(BAC~(-HVT-HA) KAN~+) PCR验证 | 第40-41页 |
| 2.2.6 BAC~(HVT-G)-H5的PCR验证 | 第41-42页 |
| 2.3 重组病毒HVT~(BAC)-H5的获得 | 第42-44页 |
| 3 试验结果 | 第44-49页 |
| 3.1 HA表达盒的验证 | 第44-45页 |
| 3.1.1 质粒PT-PHAE HA基因的酶切鉴定 | 第44页 |
| 3.1.2 质粒PT-PHAE-Kan~+基因的PCR扩增 | 第44-45页 |
| 3.2 表达HA火鸡疱疹病毒转移载体的验证 | 第45-48页 |
| 3.2.1 HA表达盒添加同源臂 | 第45-46页 |
| 3.2.2 重组BAC质粒BAC~(HVT-HA) Kan~+PCR验证 | 第46-47页 |
| 3.2.3 转移载体HA重组HVTBAC(BAC~(HVT-G)-H5)的PCR验证 | 第47页 |
| 3.2.4 RFLP验证BAC~(HVT-G)、BAC~(HVT-HA) KAN~+、BAC~(HVT-G)-H5 | 第47-48页 |
| 3.3 重组病毒的获得与纯化 | 第48-49页 |
| 4 讨论 | 第49-52页 |
| 参考文献 | 第52-53页 |
| 第三章 表达H5N1亚型禽流感病毒HA重组火鸡疱疹病毒的鉴定 | 第53-63页 |
| 1 材料 | 第53-54页 |
| 1.1 病毒与细胞 | 第53页 |
| 1.2 主要试剂 | 第53页 |
| 1.3 主要仪器设备 | 第53-54页 |
| 2 试验方法 | 第54-56页 |
| 2.1 重组病毒HVT~(BAC)-H5 PCR鉴定和序列测序 | 第54-55页 |
| 2.1.1 重组病毒HVT~(BAC)-H5基因组DNA的提取 | 第54页 |
| 2.1.1 重组病毒HVT~(BAC)-H5 PCR扩增表达盒 | 第54-55页 |
| 2.2 重组病毒HA基因表达产物western blot鉴定 | 第55-56页 |
| 2.3 重组病毒HVT~(BAC)-H5血凝试验鉴定 | 第56页 |
| 2.3.1 1%鸡红细胞悬液配制 | 第56页 |
| 2.3.2 血凝试验 | 第56页 |
| 2.4 重组病毒HVT~(BAC)-H5遗传稳定性鉴定 | 第56页 |
| 3 试验结果 | 第56-59页 |
| 3.1 重组病毒HVT~(BAC)-H5 HA表达盒的PCR扩增 | 第56-57页 |
| 3.2 重组病毒HVT~(BAC)-H5 HA基因表达产物western blot鉴定结果 | 第57页 |
| 3.3 重组病毒HVT~(BAC)-H5血凝试验结果 | 第57-58页 |
| 3.4 重组病毒遗传稳定性检测结果 | 第58-59页 |
| 4 讨论 | 第59-61页 |
| 参考文献 | 第61-63页 |
| 全文总结 | 第63-64页 |
| 致谢 | 第64页 |
