| 摘要 | 第7-9页 |
| ABSTRACT | 第9-10页 |
| 缩略语表 | 第11-13页 |
| 1 文献综述 | 第13-22页 |
| 1.1 弓形虫及弓形虫病 | 第13页 |
| 1.2 弓形虫生活史 | 第13-14页 |
| 1.3 弓形虫病原及形态特征 | 第14-15页 |
| 1.4 速殖子和缓殖子的相互转化 | 第15-16页 |
| 1.5 速殖子与缓殖子的区别 | 第16-17页 |
| 1.6 弓形虫入侵宿主细胞机制 | 第17-19页 |
| 1.6.1 弓形虫微线体蛋白 | 第18-19页 |
| 1.7 弓形虫转基因技术 | 第19-22页 |
| 1.7.1 转基因方法 | 第19页 |
| 1.7.2 转基因载体 | 第19-20页 |
| 1.7.3 CRISPR/Cas9系统 | 第20-22页 |
| 2 弓形虫阶段特异双荧光突变株的构建 | 第22-47页 |
| 2.1 研究目的与意义 | 第22-23页 |
| 2.2 材料与方法 | 第23-30页 |
| 2.2.1 实验材料 | 第23-27页 |
| 2.2.1.1 实验动物 | 第23页 |
| 2.2.1.2 虫株、菌株和细胞 | 第23页 |
| 2.2.1.3 载体与质粒 | 第23-26页 |
| 2.2.1.4 引物 | 第26-27页 |
| 2.2.2 主要仪器与试剂 | 第27-29页 |
| 2.2.2.1 主要仪器 | 第27-28页 |
| 2.2.2.2 主要试剂盒 | 第28页 |
| 2.2.2.3 主要试剂 | 第28-29页 |
| 2.2.3 主要溶液配制 | 第29-30页 |
| 2.2.3.1 细胞培养基及其配制 | 第29页 |
| 2.2.3.2 大肠杆菌培养基及其配制 | 第29页 |
| 2.2.3.3 碱裂解法质粒提取溶液及其配制 | 第29页 |
| 2.2.3.4 琼脂糖凝胶电泳液 | 第29-30页 |
| 2.2.3.5 电转缓冲液 | 第30页 |
| 2.3 实验方法 | 第30-38页 |
| 2.3.1 弓形虫RH株速殖子的培养、收集与纯化 | 第30-31页 |
| 2.3.1.1 小鼠体内弓形虫RH株速殖子传代培养 | 第30页 |
| 2.3.1.2 弓形虫RH株速殖子的纯化 | 第30-31页 |
| 2.3.1.3 弓形虫RH株基因组DNA的提取 | 第31页 |
| 2.3.2 弓形虫SAG1、BAG1启动子和GRA2终止子编码序列的获得 | 第31-32页 |
| 2.3.2.1 弓形虫SAG1p、BAG1p和GRA2t的生物信息学分析 | 第31-32页 |
| 2.3.2.2 弓形虫SAG1、BAG1启动子和GRA2终止子的PCR扩增 | 第32页 |
| 2.3.3 同源重组载体的构建 | 第32-38页 |
| 2.3.3.1 overlap PCR扩增融合片段 | 第32-33页 |
| 2.3.3.2 目的片段回收与纯化 | 第33-34页 |
| 2.3.3.3 回收片段与pEASY-Blunt载体的连接 | 第34页 |
| 2.3.3.4 大肠杆菌化学感受态细胞的制备 | 第34-35页 |
| 2.3.3.5 连接产物的转化 | 第35页 |
| 2.3.3.6 质粒提取 | 第35页 |
| 2.3.3.7 质粒的酶切鉴定 | 第35-36页 |
| 2.3.3.8 重组质粒的构建 | 第36页 |
| 2.3.3.9 重组质粒序列的测定与比对分析 | 第36页 |
| 2.3.3.10 HFF成纤维细胞的培养 | 第36-37页 |
| 2.3.3.11 去内毒素质粒的提取 | 第37-38页 |
| 2.3.3.12 电穿孔法转染弓形虫RH株 | 第38页 |
| 2.3.3.13 质粒转染虫株在细胞中的药物筛选 | 第38页 |
| 2.4 结果与分析 | 第38-47页 |
| 2.4.1 弓形虫SAG1p、BAG1p和GRA2t编码基因的获得 | 第38-39页 |
| 2.4.2 绿荧光蛋白GFP和红荧光蛋白RFP编码基因的获得 | 第39-40页 |
| 2.4.3 SAG1p-GFP-GRA2t和BAG1p-RFP-GRA2t融合片段获得 | 第40-41页 |
| 2.4.4 带有上述融合片段转染质粒pcDNA3.1(+)获得 | 第41-42页 |
| 2.4.5 带有DHFR药物标记的转染质粒pcDNA3.1(+)获得 | 第42-43页 |
| 2.4.6 突变株弓形虫的筛选获得 | 第43-44页 |
| 2.4.7 突变株荧光弓形虫的PCR鉴定 | 第44-45页 |
| 2.4.8 讨论 | 第45-47页 |
| 2.4.8.1 观察弓形虫速殖子缓殖子体外转化可行性 | 第45页 |
| 2.4.8.2 弓形虫电转化技术的选择 | 第45-47页 |
| 3 弓形虫MIC3缺失突变株的构建 | 第47-63页 |
| 3.1 研究目的和意义 | 第47-48页 |
| 3.2 材料与方法 | 第48-49页 |
| 3.2.1 实验材料 | 第48-49页 |
| 3.2.1.1 实验动物 | 第48页 |
| 3.2.1.2 虫株、菌株和细胞 | 第48页 |
| 3.2.1.3 载体与质粒 | 第48-49页 |
| 3.2.1.4 引物 | 第49页 |
| 3.3 实验方法 | 第49-57页 |
| 3.3.1 弓形虫RH株速殖子的培养、收集与纯化 | 第49-57页 |
| 3.3.1.1 小鼠体内弓形虫RH株速殖子传代培养 | 第49-50页 |
| 3.3.1.2 弓形虫RH株速殖子的纯化 | 第50页 |
| 3.3.1.3 弓形虫RH株基因组DNA的提取 | 第50-51页 |
| 3.3.1.4 HFF成纤维细胞的培养 | 第51页 |
| 3.3.1.5 CRISPR质粒的构建 | 第51-53页 |
| 3.3.1.6 具有同源臂的筛选标记质粒(GOI-DHFR)的构建 | 第53-54页 |
| 3.3.1.7 去内毒素质粒的提取 | 第54-55页 |
| 3.3.1.8 CRISPR转染质粒和同源模板的制备 | 第55页 |
| 3.3.1.9 弓形虫的转染 | 第55页 |
| 3.3.1.10 基因敲除弓形虫的筛选 | 第55-57页 |
| 3.3.1.11 小鼠毒力实验 | 第57页 |
| 3.4 结果与分析 | 第57-63页 |
| 3.4.1 MIC3敲除质粒的构建 | 第57页 |
| 3.4.2 MIC3敲除株的PCR1，PCR2和PCR3结果 | 第57-58页 |
| 3.4.3 MIC3敲除株的噬斑试验 | 第58-59页 |
| 3.4.4 MIC3敲除株的小鼠毒力实验 | 第59页 |
| 3.4.5 MIC3敲除株的生长实验 | 第59-60页 |
| 3.4.6 讨论 | 第60-63页 |
| 3.4.6.1 弓形虫微线体蛋白的重要性 | 第60-61页 |
| 3.4.6.2 CRISPR/Cas9系统的高效准确性 | 第61-63页 |
| 4 结论 | 第63-64页 |
| 参考文献 | 第64-71页 |
| 致谢 | 第71页 |
