| 摘要 | 第6-7页 |
| Abstract | 第7页 |
| 第一章 引言 | 第13-18页 |
| 1.1 嵴病毒综述 | 第13-17页 |
| 1.1.1 病毒的生物学分类 | 第13-14页 |
| 1.1.2 嵴病毒的生物学特性 | 第14-15页 |
| 1.1.2.1 嵴病毒的理化特性 | 第14页 |
| 1.1.2.2 嵴病毒的基因组结构及功能 | 第14页 |
| 1.1.2.3 嵴病毒的蛋白结构及功能 | 第14-15页 |
| 1.1.3 嵴病毒的流行病学特征 | 第15-16页 |
| 1.1.4 嵴病毒的检测 | 第16页 |
| 1.1.4.1 病毒的分离培养 | 第16页 |
| 1.1.4.2 电镜技术 | 第16页 |
| 1.1.4.3 PCR技术及测序分析 | 第16页 |
| 1.1.4.4 血清学和免疫学检测方法 | 第16页 |
| 1.1.5 嵴病毒的防控措施 | 第16-17页 |
| 1.1.6 展望 | 第17页 |
| 1.2 本研究的目的与意义 | 第17-18页 |
| 第二章 甘肃地区猪嵴病毒分子流行病学调查 | 第18-25页 |
| 2.1 材料与方法 | 第18-21页 |
| 2.1.1 样品采集 | 第18页 |
| 2.1.2 主要试剂 | 第18页 |
| 2.1.3 引物设计 | 第18-19页 |
| 2.1.4 RNA提取与RT-PCR | 第19页 |
| 2.1.5 重组质粒的构建 | 第19-21页 |
| 2.1.6 遗传进化关系分析 | 第21页 |
| 2.1.7 相关性分析 | 第21页 |
| 2.2 结果 | 第21-24页 |
| 2.2.1 检测猪群的感染状况 | 第21-23页 |
| 2.2.2 遗传进化分析结果 | 第23-24页 |
| 2.2.3 相关性分析结果 | 第24页 |
| 2.3 讨论 | 第24-25页 |
| 第三章 猪嵴病毒全长CDNA的构建 | 第25-33页 |
| 3.1 材料与方法 | 第25-29页 |
| 3.1.1 病毒、载体与菌株 | 第25页 |
| 3.1.2 主要试剂和仪器 | 第25页 |
| 3.1.3 PKV CH441全基因组扩增引物设计 | 第25-26页 |
| 3.1.4 全基因组分段扩增及测序 | 第26页 |
| 3.1.4.1 RNA的提取与RT-PCR | 第26页 |
| 3.1.4.2 重组质粒的构建 | 第26页 |
| 3.1.5 全基因组序列的拼接与分析 | 第26页 |
| 3.1.6 限制性内切酶位点的选择 | 第26-27页 |
| 3.1.7 CH441全基因组分段 | 第27-28页 |
| 3.1.8 PKV CH441的体外转录 | 第28-29页 |
| 3.2 结果 | 第29-31页 |
| 3.2.1 全基因组各片段的扩增结果 | 第29页 |
| 3.2.2 CH441全基因组序列比对分析结果 | 第29-31页 |
| 3.2.3 构建全长cDNA双酶切鉴定图 | 第31页 |
| 3.3 讨论 | 第31-33页 |
| 第四章 猪嵴病毒 3C蛋白结构分析及其多克隆抗体的制备 | 第33-46页 |
| 4.1 材料与方法 | 第33-37页 |
| 4.1.1 材料 | 第33-34页 |
| 4.1.1.1 病毒、载体、菌株 | 第33页 |
| 4.1.1.2 主要试剂 | 第33-34页 |
| 4.1.2 实验方法 | 第34-37页 |
| 4.1.2.1 引物设计与合成 | 第34页 |
| 4.1.2.2 3C基因的扩增 | 第34页 |
| 4.1.2.3 重组质粒的构建 | 第34页 |
| 4.1.2.4 表达条件的优化 | 第34-35页 |
| 4.1.2.5 重组蛋白的可溶性分析 | 第35页 |
| 4.1.2.6 重组蛋白的诱导表达 | 第35页 |
| 4.1.2.7 重组蛋白的纯化 | 第35页 |
| 4.1.2.8 PKV3C蛋白的序列分析 | 第35-36页 |
| 4.1.2.9 生物信息学分析 | 第36页 |
| 4.1.2.10 兔源多克隆抗 3C免疫血清的制备 | 第36页 |
| 4.1.2.11 多克隆抗体的反应原性的Western- blot分析 | 第36-37页 |
| 4.2 结果与分析 | 第37-45页 |
| 4.2.1 3C基因的RT-PCR扩增结果 | 第37页 |
| 4.2.2 重组质粒pMD19-T-3C PCR及双酶切鉴定 | 第37-38页 |
| 4.2.3 重组表达质粒pET-30a-3C双酶切鉴定 | 第38-39页 |
| 4.2.4 重组蛋白的可溶性分析 | 第39页 |
| 4.2.5 表达条件的优化 | 第39-40页 |
| 4.2.6 重组蛋白的纯化 | 第40-41页 |
| 4.2.7 猪嵴病CH441株 3C基因核苷酸序列分析及遗传进化分析 | 第41-42页 |
| 4.2.8 3C基因编码产物的理化性质分析 | 第42页 |
| 4.2.9 信号肽分析 | 第42-43页 |
| 4.2.10 跨膜区分析 | 第43页 |
| 4.2.11 3C蛋白的磷酸化位点的预测 | 第43页 |
| 4.2.12 3C蛋白结构与功能预测 | 第43页 |
| 4.2.13 3C蛋白的二级结构预测 | 第43-44页 |
| 4.2.14 3C蛋白的三级结构预测 | 第44页 |
| 4.2.15 多克隆抗体的反应原性的Western blotting分析 | 第44-45页 |
| 4.3 讨论 | 第45-46页 |
| 第五章 猪嵴病毒RNAI基因治疗的研究 | 第46-52页 |
| 5.1 实验材料与方法 | 第47-48页 |
| 5.1.1 材料 | 第47页 |
| 5.1.2 试剂 | 第47页 |
| 5.1.3 仪器 | 第47页 |
| 5.1.4 shRNA靶位点的选择 | 第47页 |
| 5.1.5 shRNA引物的设计 | 第47页 |
| 5.1.6 慢病毒的包装 | 第47-48页 |
| 5.2 慢病毒滴度测定 | 第48-49页 |
| 5.3 RNAI稳转细胞系的筛选 | 第49页 |
| 5.3.1 嘌呤霉素最适浓度的选择 | 第49页 |
| 5.3.2 MOI的筛选 | 第49页 |
| 5.3.3 稳转细胞系的筛选 | 第49页 |
| 5.4 实验结果和数据 | 第49-51页 |
| 5.4.1 病毒滴度测定结果 | 第49-50页 |
| 5.4.2 稳转细胞系的筛选结果 | 第50-51页 |
| 5.5 讨论 | 第51-52页 |
| 第六章 全文结论 | 第52-53页 |
| 参考文献 | 第53-58页 |
| 致谢 | 第58-59页 |
| 作者简历 | 第59页 |
