| 摘要 | 第5-7页 |
| Abstract | 第7-9页 |
| 第一章 前言 | 第13-28页 |
| 1.1 纤维小体 | 第13-17页 |
| 1.1.1 脚架蛋白 | 第14页 |
| 1.1.2 Cohesin和dockerin模块 | 第14-16页 |
| 1.1.3 酶亚基 | 第16页 |
| 1.1.4 纤维小体的多样性 | 第16-17页 |
| 1.2 ECF sigma因子的研究进展 | 第17-19页 |
| 1.2.1 ECF sigma因子属于σ~(70)家族 | 第17页 |
| 1.2.2 ECF sigma因子的作用 | 第17页 |
| 1.2.3 ECF sigma因子的特点 | 第17-18页 |
| 1.2.4 ECF sigma因子的信号传导机制 | 第18-19页 |
| 1.3 热纤梭菌中sigma-anti-sigma因子的研究进展 | 第19-22页 |
| 1.3.1 热纤梭菌中sigma-anti-sigma因子的发现 | 第19页 |
| 1.3.2 sigma因子的结构特点 | 第19页 |
| 1.3.3 anti-sigma因子的结构特点 | 第19-20页 |
| 1.3.4 anti-sigma因子对胞外多糖的特异性识别 | 第20-21页 |
| 1.3.5 anti-sigma与sigma因子的特异性相互作用 | 第21页 |
| 1.3.6 sigma因子和纤维小体基因表达的相关性 | 第21-22页 |
| 1.3.7 已有的anti-sigma-sigma因子的调控模型 | 第22页 |
| 1.4 蛋白纯化遇到的常见问题 | 第22-25页 |
| 1.4.1 蛋白的稳定性 | 第23页 |
| 1.4.2 蛋白的表达量 | 第23-24页 |
| 1.4.3 蛋白纯化方法的选择 | 第24-25页 |
| 1.5 蛋白结构解析的常用方法 | 第25-26页 |
| 1.6 课题研究内容与意义 | 第26-28页 |
| 第二章 热纤梭菌RsgI2胞内结构域重组载体的克隆、表达纯化及NMR结构分析 | 第28-47页 |
| 2.1 热纤梭菌anti-sigma因子的选择 | 第28-30页 |
| 2.2 实验材料 | 第30-31页 |
| 2.2.1 质粒与菌株 | 第30页 |
| 2.2.2 分子生物学相关试剂 | 第30-31页 |
| 2.2.3 主要仪器一览表(表2-1) | 第31页 |
| 2.3 实验方法 | 第31-39页 |
| 2.3.1 构建含单一目的基因的重组载体 | 第31-33页 |
| 1) 目的片段的获得 | 第31-32页 |
| 2) 载体和目的基因双酶切 | 第32页 |
| 3) 载体和目的片段连接 | 第32-33页 |
| 4) 转化克隆菌株DH5α | 第33页 |
| 5) 阳性克隆筛选与测序验证 | 第33页 |
| 6) 转化菌株BL21 | 第33页 |
| 2.3.2 重组载体的表达与优化 | 第33-34页 |
| 2.3.3 对已构建的载体进行点突变 | 第34页 |
| 2.3.4 蛋白纯化方法 | 第34-37页 |
| 2.3.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳方法 | 第37-38页 |
| 2.3.6 浓缩管的使用 | 第38页 |
| 2.3.7 NMR样品的制备 | 第38页 |
| 2.3.8 NMR滴定实验 | 第38页 |
| 2.3.9 数据的处理、分析及结构计算 | 第38-39页 |
| 2.4 实验结果矛口讨论 | 第39-46页 |
| 2.4.1 RsgI2-ND的表达纯化 | 第39-43页 |
| 1) RsgI2-ND的预表达 | 第39页 |
| 2) RsgI2-ND的表达纯化 | 第39-41页 |
| 3) 初步的NMR分析 | 第41-42页 |
| 4) RsgI-ND突变体的表达纯化 | 第42-43页 |
| 2.4.2 化学位移指认 | 第43-44页 |
| 2.4.3 RsgI2-ND(L23D)的结构解析 | 第44-45页 |
| 2.4.4 RsgI2-ND(L23D)与单糖、二糖的作用 | 第45-46页 |
| 2.5 本章小结 | 第46-47页 |
| 第三章 热纤梭菌RsgI2周质空间结构域重组载体的克隆、表达纯化及NMR结构分析 | 第47-61页 |
| 3.1 Cthe 0267编码的anti-sigma因子存在周质空间结构域 | 第47-48页 |
| 3.2 实验方法 | 第48-51页 |
| 3.2.1 构建含单一目的基因的重组载体 | 第48-49页 |
| 3.2.2 重组载体的表达与优化 | 第49页 |
| 3.2.3 蛋白纯化方法 | 第49-51页 |
| 3.2.4 NMR样品的制备 | 第51页 |
| 3.2.5 数据的处理、分析和结构计算 | 第51页 |
| 3.3 实验结果与讨论 | 第51-59页 |
| 3.3.1 RsgI2-PD表达载体的表达纯化 | 第51-56页 |
| 1) RsgI2-PD-30a(86-259)的表达纯化 | 第51-52页 |
| 2) RsgI2-PD-SMT(86-259)的表达纯化 | 第52-53页 |
| 3) RsgI2-PD-30a(86-259)的稳定性实验 | 第53页 |
| 4) 截取不同长度的RsgI2-PD | 第53-55页 |
| 5) RsgI2-PD-30a(89-248)的表达优化 | 第55页 |
| 6) RsgI2-PD-30a(89-248)的表达纯化 | 第55-56页 |
| 3.3.2 化学位移指认 | 第56-58页 |
| 3.3.3 RsgI2-PD-30a(89-248)的结构解析 | 第58-59页 |
| 3.4 本章小结 | 第59-61页 |
| 第四章 Sigma-anti-sigma因子信号传导机制的初步研究 | 第61-75页 |
| 4.1 热纤梭菌sigma的选择 | 第61页 |
| 4.2 实验方法 | 第61-64页 |
| 4.2.1 构建含单一目的基因的重组载体 | 第61页 |
| 4.2.2 重组载体的表达与优化 | 第61页 |
| 4.2.3 蛋白纯化方法 | 第61-63页 |
| 4.2.4 蛋白与启动子之间的EMSA实验 | 第63页 |
| 4.2.5 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第63-64页 |
| 4.2.6 凝胶过滤层析技术 | 第64页 |
| 4.2.7 NMR滴定实验 | 第64页 |
| 4.3 实验结果与讨论 | 第64-73页 |
| 4.3.1 SigI2的表达纯化 | 第64-68页 |
| 4.3.2 启动子识别机制 | 第68-69页 |
| 4.3.3 sigma-anti-sigma识别机制 | 第69-73页 |
| 1) 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检验蛋白间的相互作用 | 第69-70页 |
| 2) 凝胶过滤层析技术检验蛋白间的相互作用 | 第70-72页 |
| 3) NMR滴定实验检验蛋白间的相互作用 | 第72-73页 |
| 4.4 本章小结 | 第73-75页 |
| 第五章 论文总结和展望 | 第75-77页 |
| 5.1 总结 | 第75-76页 |
| 5.1.1 热纤梭菌RsgI2胞内结构域的表达纯化及NMR结构分析 | 第75页 |
| 5.1.2 热纤梭菌RsgI2周质空间结构域的表达纯化及NMR结构分析 | 第75页 |
| 5.1.3 Sigma-anti-sigma因子信号传导机制的初步研究 | 第75-76页 |
| 5.2 展望 | 第76-77页 |
| 参考文献 | 第77-81页 |
| 附录 | 第81-84页 |
| 致谢 | 第84-85页 |
| 个人简历 | 第85页 |
| 发表的学术论文 | 第85页 |
