| 摘要 | 第5-7页 |
| Abstract | 第7-9页 |
| 0 前言 | 第15-28页 |
| 0.1 琼胶(agar)及琼寡糖 | 第15-16页 |
| 0.2 琼胶酶 | 第16-25页 |
| 0.2.1 琼胶酶分类 | 第16-18页 |
| 0.2.2 琼胶酶来源及性质 | 第18-20页 |
| 0.2.3 琼胶酶的基因克隆及重组表达 | 第20-22页 |
| 0.2.4 琼胶酶的晶体结构研究 | 第22-24页 |
| 0.2.5 琼胶酶的应用 | 第24-25页 |
| 0.3 前期工作及展望 | 第25-28页 |
| 1 agaD序列密码子优化及不同表达宿主的表达 | 第28-41页 |
| 1.1 实验材料与仪器 | 第28-29页 |
| 1.1.1 实验仪器 | 第28-29页 |
| 1.1.2 实验试剂和材料 | 第29页 |
| 1.2 实验方法 | 第29-33页 |
| 1.2.1 agaD序列分析及密码子优化 | 第29-30页 |
| 1.2.2 优化后目的基因的获得 | 第30-31页 |
| 1.2.3 制备pET-22b(+)载体 | 第31页 |
| 1.2.4 构建重组表达体系 | 第31-32页 |
| 1.2.5 optagaD基因的诱导表达 | 第32页 |
| 1.2.6 酶活的测定 | 第32-33页 |
| 1.2.7 常规最适表达条件的确定 | 第33页 |
| 1.3 实验结果 | 第33-39页 |
| 1.3.1 优化目的基因 | 第33-34页 |
| 1.3.2 获得优化后的目的片段optagaD | 第34页 |
| 1.3.3 pET-22b(+)载体制备 | 第34-35页 |
| 1.3.4 连接后的酶切鉴定 | 第35页 |
| 1.3.5 DNS法测定酶活所使用的D-半乳糖标准曲线 | 第35-36页 |
| 1.3.6 转化不同宿主发酵上清的酶活力测定 | 第36-37页 |
| 1.3.7 最适表达条件的确定 | 第37-39页 |
| 1.4 小结及讨论 | 第39-41页 |
| 2 N端第2个氨基酸突变体构建 | 第41-49页 |
| 2.1 实验仪器与材料 | 第41-42页 |
| 2.1.1 实验仪器 | 第41-42页 |
| 2.1.2 实验试剂和材料 | 第42页 |
| 2.2 实验方法 | 第42-46页 |
| 2.2.1 将目的基因N端突变 | 第42-44页 |
| 2.2.2 制备pET-22b(+)载体 | 第44-45页 |
| 2.2.3 建立重组表达系统 | 第45页 |
| 2.2.4 optagaDx基因的表达 | 第45-46页 |
| 2.3 实验结果 | 第46-47页 |
| 2.3.1 突变后基因的获取 | 第46页 |
| 2.3.2 制备pET-22b(+)载体 | 第46页 |
| 2.3.4 酶切鉴定连接后产物 | 第46-47页 |
| 2.3.5 突变前后产酶情况比较 | 第47页 |
| 2.4 小结及讨论 | 第47-49页 |
| 3 摇瓶培养初步优化 | 第49-56页 |
| 3.1 实验仪器与材料 | 第49-50页 |
| 3.1.1 实验仪器 | 第49页 |
| 3.1.2 实验材料 | 第49-50页 |
| 3.2 实验方法 | 第50-51页 |
| 3.2.1 种子培养液的培养 | 第50页 |
| 3.2.2 不同的装样量 | 第50页 |
| 3.2.3 在培养基中添加不同碳源或消泡剂 | 第50页 |
| 3.2.4 在培养基中添加CaCl_2 | 第50页 |
| 3.2.5 在培养基中添加Gly | 第50-51页 |
| 3.2.6 常规最适表达条件的确定 | 第51页 |
| 3.2.7 酶活测定方法 | 第51页 |
| 3.3 实验结果 | 第51-54页 |
| 3.3.1 不同装样量对酶活的影响 | 第51页 |
| 3.3.2 在培养基中添加不同碳源或消泡剂 | 第51-52页 |
| 3.3.3 在培养基中添加CaCl_2 | 第52-53页 |
| 3.3.4 在培养基中添加Gly | 第53-54页 |
| 3.3.5 常规最适表达条件的确定 | 第54页 |
| 3.4 小结及讨论 | 第54-56页 |
| 4 重组琼胶酶AgaD的纯化及检测 | 第56-75页 |
| 4.1 实验仪器与材料 | 第56-57页 |
| 4.1.1 实验仪器 | 第56-57页 |
| 4.1.2 实验试剂 | 第57页 |
| 4.2 实验方法 | 第57-64页 |
| 4.2.1 AgaD琼胶酶的发酵 | 第57页 |
| 4.2.2 NaCl及CaCl_2对酶活的影响 | 第57-58页 |
| 4.2.3 硫酸铵沉淀发酵液 | 第58-59页 |
| 4.2.4 离子交换层析 | 第59页 |
| 4.2.5 镍离子层析 | 第59页 |
| 4.2.6 疏水作用层析 | 第59-60页 |
| 4.2.7 酶活测定方法 | 第60页 |
| 4.2.8 蛋白质浓度及比活力测定 | 第60页 |
| 4.2.9 蛋白电泳检测 | 第60页 |
| 4.2.10 His抗体检测目的蛋白 | 第60-61页 |
| 4.2.11 构建Ecoli AD494(DE3)-pET-22b(+)-optagaDx-Flag表达体系 | 第61-64页 |
| 4.2.12 optagaDx-Flag基因的表达及Western-blot检测 | 第64页 |
| 4.2.13 胶复性检测目的蛋白 | 第64页 |
| 4.3 实验结果 | 第64-74页 |
| 4.3.1 硫酸铵沉淀 | 第64-65页 |
| 4.3.2 NaCl及CaCl_2对酶活的影响 | 第65-66页 |
| 4.3.3 离子交换层析 | 第66-67页 |
| 4.3.4 镍离子柱层析 | 第67-68页 |
| 4.3.5 疏水作用层析 | 第68-69页 |
| 4.3.6 蛋白含量的测定 | 第69-70页 |
| 4.3.7 蛋白电泳检测 | 第70-71页 |
| 4.3.8 His抗体检测目的蛋白 | 第71-72页 |
| 4.3.9 构建Ecoli AD494(DE3)-pET-22b(+)-optagaDx-Flag表达体系 | 第72页 |
| 4.3.10 optagaDx-Flag基因的表达及Western-blot检测 | 第72-73页 |
| 4.3.11 胶复性检测目的蛋白 | 第73-74页 |
| 4.4 小结及讨论 | 第74-75页 |
| 5 AgaD重组琼胶酶初步研究 | 第75-85页 |
| 5.1 实验仪器与材料 | 第75-76页 |
| 5.1.1 实验仪器 | 第75-76页 |
| 5.1.2 实验材料 | 第76页 |
| 5.2 实验方法 | 第76-78页 |
| 5.2.1 获得琼胶寡糖标准品 | 第76页 |
| 5.2.2 获得AgaD降解产物 | 第76页 |
| 5.2.3 TLC层析鉴定寡糖 | 第76-77页 |
| 5.2.4 AgaD降解不同的寡糖 | 第77页 |
| 5.2.5 AgaD不同时间降解产物 | 第77页 |
| 5.2.6 荧光辅助碳水化合物电泳(FACE)检测降解情况 | 第77-78页 |
| 5.3 实验结果 | 第78-84页 |
| 5.3.1 新琼寡糖的制备及定量结果 | 第78-79页 |
| 5.3.2 AgaD降解琼脂糖酶的补加策略 | 第79-80页 |
| 5.3.3 AgaD降解琼脂糖的终产物分析 | 第80-81页 |
| 5.3.4 AgaD最小底物确定 | 第81-82页 |
| 5.3.5 AgaD降解琼脂糖的Time course曲线 | 第82-84页 |
| 5.4 小结与讨论 | 第84-85页 |
| 总结及展望 | 第85-86页 |
| 参考文献 | 第86-91页 |
| 附录 | 第91-103页 |
| 附录1 培养基、试剂及溶液的配制 | 第91-96页 |
| 附录2 常用分子生物学实验方法 | 第96-101页 |
| 附录3 缩略词 | 第101-103页 |
| 致谢 | 第103-104页 |
| 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果 | 第104页 |
