| 摘要 | 第3-4页 |
| Abstract | 第4-5页 |
| 中英文缩略词表 | 第8-9页 |
| 第1章 引言 | 第9-22页 |
| 1.1 BRD4的研究背景 | 第9-15页 |
| 1.1.1 表观遗传的发展进程 | 第9-11页 |
| 1.1.2 Bromodomain and Extra-terminal(BET)家族蛋白及BRD4生物学功能介绍 | 第11-12页 |
| 1.1.3 Bromodomain and Extra-terminal (BET)家族蛋白现有抑制剂 | 第12-14页 |
| 1.1.4 小结与展望 | 第14-15页 |
| 1.2 RhoA的研究背景 | 第15-21页 |
| 1.2.1 RAS超家族的成员 | 第15-17页 |
| 1.2.2 Rho蛋白的生理学功能 | 第17-18页 |
| 1.2.3 Rho与肿瘤的关系 | 第18-20页 |
| 1.2.4 靶向RhoA蛋白的现有抑制剂研究 | 第20-21页 |
| 1.3 总结与展望 | 第21-22页 |
| 第2章 靶向BRD4先导化合物发现以及作用机制研究 | 第22-45页 |
| 2.1 实验方法 | 第22-30页 |
| 2.1.1 BRD4-BD1的质粒构建;蛋白表达及纯化 | 第22-24页 |
| 2.1.2 AlphaScreen高通量筛选平台的建立 | 第24-26页 |
| 2.1.3 蛋白热迁移实验(Protein thermal shift assay) | 第26-27页 |
| 2.1.4 BD1空蛋白晶体准备以及复合物共晶解析 | 第27页 |
| 2.1.5 细胞增殖抑制实验 | 第27-28页 |
| 2.1.6 细胞周期检测实验 | 第28页 |
| 2.1.7 细胞凋亡检测实验 | 第28页 |
| 2.1.8 实时荧光定量PCR | 第28-29页 |
| 2.1.9 Western Blot检测胞内C-myc含量 | 第29-30页 |
| 2.2 实验结果与讨论 | 第30-44页 |
| 2.2.1 BRD4-BD1蛋白的纯化 | 第30-31页 |
| 2.2.2 苗头化合物的发现及体外确证 | 第31-39页 |
| 2.2.3 BRD4-BD1空蛋白晶体的获得及复合物晶体的解析 | 第39-42页 |
| 2.2.4 DCBD-005细胞水平的靶标确证 | 第42-44页 |
| 2.3 小结 | 第44-45页 |
| 第3章 靶向RhoA先导化合物发现以及作用机制研究 | 第45-60页 |
| 3.1 实验方法 | 第45-53页 |
| 3.1.1 RhoA蛋白表达及纯化 | 第45-46页 |
| 3.1.2 靶向RhoA小分子抑制剂筛选的平台建立 | 第46页 |
| 3.1.3 RhoA蛋白的酶活性测试 | 第46-47页 |
| 3.1.4 二维核磁共振技术 | 第47-49页 |
| 3.1.5 质谱检测 | 第49页 |
| 3.1.6 化合物作用位点的确定及分子动力学模拟(MD)分析 | 第49页 |
| 3.1.7 GDP/GTP交换实验 | 第49-50页 |
| 3.1.8 检测RhoA下游MLC蛋白的磷酸化 | 第50-51页 |
| 3.1.9 检测RhoA蛋白的胞内活性(RBD pull down实验) | 第51-52页 |
| 3.1.10 免疫荧光 | 第52-53页 |
| 3.2 实验结果与讨论 | 第53-59页 |
| 3.2.1 先导化合物Cpd1的发现及活性确证 | 第53-54页 |
| 3.2.2 二维核磁实验进一步验证化合物与RhoA的结合 | 第54-55页 |
| 3.2.3 质谱检测验证小分子与蛋白的共价结合 | 第55页 |
| 3.2.4 Cpd1结合位点的确证及动力学模拟分析 | 第55-56页 |
| 3.2.5 Cpd1抑制GDP/GTP的交换速率 | 第56-57页 |
| 3.2.6 Cpd1影响下游信号通路中MLC蛋白的磷酸化 | 第57-58页 |
| 3.2.7 Cpd1蛋白显著下调胞内RhoA-GTP水平 | 第58页 |
| 3.2.8 Cpd1可抑制细胞应力纤维的形成 | 第58-59页 |
| 3.3 小结 | 第59-60页 |
| 第4章 总结及展望 | 第60-61页 |
| 致谢 | 第61-62页 |
| 参考文献 | 第62-68页 |
| 攻读学位期间的研究成果 | 第68-69页 |
| 综述 | 第69-77页 |
| 参考文献 | 第76-77页 |
