| 摘要 | 第3-4页 |
| Abstract | 第4-5页 |
| 第一章 绪论 | 第9-18页 |
| 1.1 苯丙氨酸羟化酶概述 | 第9-10页 |
| 1.2 苯丙酮尿症 | 第10-11页 |
| 1.3 苯丙氨酸羟化酶的结构及其活性调节 | 第11-13页 |
| 1.3.1 苯丙氨酸羟化酶的结构 | 第11-12页 |
| 1.3.2 苯丙氨酸羟化酶的活性调节 | 第12-13页 |
| 1.3.3 苯丙氨酸羟化酶的催化机理 | 第13页 |
| 1.4 提高酶热稳定性的改造方法 | 第13-15页 |
| 1.4.1 优化蛋白表面电荷 | 第14页 |
| 1.4.2 柔性区改造 | 第14页 |
| 1.4.3 基于脯氨酸效应的蛋白设计 | 第14页 |
| 1.4.4 基于二硫键效应的蛋白设计 | 第14-15页 |
| 1.4.5 定向进化 | 第15页 |
| 1.5 保护剂 | 第15-16页 |
| 1.6 本论文的研究意义与内容 | 第16-18页 |
| 1.6.1 立题依据及意义 | 第16页 |
| 1.6.2 主要研究内容 | 第16-18页 |
| 第二章 材料与方法 | 第18-27页 |
| 2.1 材料 | 第18-20页 |
| 2.1.1 菌种和质粒 | 第18页 |
| 2.1.2 主要试剂 | 第18页 |
| 2.1.3 培养基 | 第18页 |
| 2.1.4 实验仪器 | 第18-19页 |
| 2.1.5 常用试剂 | 第19-20页 |
| 2.2 苯丙氨酸羟化酶分子改造 | 第20-25页 |
| 2.2.1 分子改造位点选择 | 第20页 |
| 2.2.2 质粒提取 | 第20页 |
| 2.2.3 引物设计 | 第20-22页 |
| 2.2.4 全质粒PCR反应体系及反应条件 | 第22页 |
| 2.2.5 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 | 第22-23页 |
| 2.2.6 阳性克隆的鉴定 | 第23页 |
| 2.2.7 目的蛋白的诱导表达 | 第23页 |
| 2.2.8 目的蛋白的纯化 | 第23-24页 |
| 2.2.9 蛋白浓度的测定 | 第24页 |
| 2.2.10 产物检测条件 | 第24页 |
| 2.2.11 突变体酶活测定 | 第24页 |
| 2.2.12 突变体酶学最适反应温度 | 第24页 |
| 2.2.13 突变体酶最适p H | 第24-25页 |
| 2.2.14 动力学参数的测定 | 第25页 |
| 2.2.15 突变酶的结构分析 | 第25页 |
| 2.3 保护剂对苯丙氨酸羟化酶热稳定性影响 | 第25-27页 |
| 2.3.1 目的蛋白的表达与纯化 | 第25页 |
| 2.3.2 保护剂的筛选 | 第25页 |
| 2.3.3 复合保护剂组分优化 | 第25页 |
| 2.3.4 保护剂对苯丙氨酸羟化酶储存稳定性的影响 | 第25-27页 |
| 第三章 结果与讨论 | 第27-44页 |
| 3.1 N-端氨基酸对Cv PAH热稳定性和最适反应p H的影响 | 第27-32页 |
| 3.1.1 Cv PAH N-氨基酸序列分析 | 第27-28页 |
| 3.1.2 截断酶的构建 | 第28页 |
| 3.1.3 截断酶的表达及纯化 | 第28-29页 |
| 3.1.4 截断酶最适反应温度及热稳定性 | 第29-30页 |
| 3.1.5 截断酶最适反应p H | 第30-31页 |
| 3.1.6 截断酶动力学参数的测定 | 第31-32页 |
| 3.2 Ala、Arg突变对重组Cv PAH热稳定性影响 | 第32-39页 |
| 3.2.1 突变位点选择 | 第32-33页 |
| 3.2.2 突变位点保守性分析 | 第33-34页 |
| 3.2.3 突变体筛选 | 第34-35页 |
| 3.2.4 突变酶纯化 | 第35-36页 |
| 3.2.5 突变酶的最适反应温度及热稳定性 | 第36-37页 |
| 3.2.6 突变酶的Tm值 | 第37页 |
| 3.2.7 突变酶动力学参数 | 第37-38页 |
| 3.2.8 突变酶的结构分析 | 第38-39页 |
| 3.3 保护剂对重组Cv PAH的热稳定性影响 | 第39-44页 |
| 3.3.1 保护剂种类对重组Cv PAH热稳定性的影响 | 第39-40页 |
| 3.3.2 保护剂浓度对重组Cv PAH热稳定性的影响 | 第40-41页 |
| 3.3.3 复合保护剂的优化及对重组Cv PAH热稳定性的影响 | 第41-42页 |
| 3.3.4 甘油与复合保护剂对重组Cv PAH储存稳定性的影响 | 第42-44页 |
| 主要结论与展望 | 第44-45页 |
| 主要结论 | 第44页 |
| 展望 | 第44-45页 |
| 致谢 | 第45-47页 |
| 参考文献 | 第47-52页 |
| 附录: 作者在攻读硕士学位期间发表的论文 | 第52页 |
