| 致谢 | 第6-8页 |
| 摘要 | 第8-9页 |
| Abstract | 第9-10页 |
| 1 绪论 | 第16-49页 |
| 1.1 芜菁黄化花叶病毒概述 | 第16-23页 |
| 1.1.1 TYMV侵染寄主植物后引起的症状 | 第16-17页 |
| 1.1.2 TYMV病毒颗粒的形态 | 第17页 |
| 1.1.3 TYMV基因组与基因组表达 | 第17-19页 |
| 1.1.4 TYMV的复制 | 第19-21页 |
| 1.1.5 TYMV病毒粒子的移动 | 第21-22页 |
| 1.1.6 TYMV的侵染对寄主的影响 | 第22-23页 |
| 1.2 GLK家族蛋白概述 | 第23-29页 |
| 1.2.1 GLK家族蛋白的结构 | 第23-25页 |
| 1.2.2 GLK家族蛋白是调控光合作用相关基因表达的转录因子 | 第25-26页 |
| 1.2.3 GLK蛋白能特异性结合其下游基因的启动子 | 第26-27页 |
| 1.2.4 GLK蛋白参与叶片衰老过程的调节 | 第27-28页 |
| 1.2.5 GLK蛋白有助于提高植物对病原微生物胁迫的抗性 | 第28-29页 |
| 1.3 植物中miRNA介导的RNAi机制概述 | 第29-43页 |
| 1.3.1 RNAi机制概述 | 第29-30页 |
| 1.3.2 植物的miRNA | 第30-31页 |
| 1.3.3 植物中miRNA的产生、转运与代谢 | 第31-37页 |
| 1.3.3.1 植物MIR基因的转录 | 第31-33页 |
| 1.3.3.2 pri-miRNA的加工 | 第33-34页 |
| 1.3.3.3 pri-miRNA加工与转录之间的关系 | 第34-35页 |
| 1.3.3.4 pri-miRNA加工与剪接之间的关系 | 第35-36页 |
| 1.3.3.5 miRNA代谢与转运 | 第36-37页 |
| 1.3.4 植物中miRNA的功能 | 第37-43页 |
| 1.3.4.1 RISC复合体组装与功能 | 第37页 |
| 1.3.4.2 靶标基因的切割 | 第37-39页 |
| 1.3.4.3 蛋白翻译抑制 | 第39-41页 |
| 1.3.4.4 miRNA通路调节机制 | 第41页 |
| 1.3.4.5 拟南芥miRNA调控的靶标基因以及引起的生物学效应 | 第41-43页 |
| 1.4 RNA聚合酶Ⅲ概述 | 第43-49页 |
| 1.4.1 RNA聚合酶Ⅲ的亚基 | 第43-44页 |
| 1.4.2 RNA聚合酶Ⅲ的转录产物 | 第44-45页 |
| 1.4.3 RNA聚合酶Ⅲ启动子元件与转录因子 | 第45-47页 |
| 1.4.4 RNA聚合酶Ⅲ的转录起始 | 第47-49页 |
| 2 常规实验方法 | 第49-63页 |
| 2.1 植物培养 | 第49-50页 |
| 2.1.1 拟南芥在营养土中培养 | 第49页 |
| 2.1.2 拟南芥在1/2 MS平板上培养或转基因筛选 | 第49-50页 |
| 2.2 拟南芥基因组DNA提取 | 第50页 |
| 2.3 植物总RNA提取与cDNA第一链的反转录 | 第50-52页 |
| 2.3.1 植物总RNA提取 | 第50-51页 |
| 2.3.2 DNA酶消化 | 第51-52页 |
| 2.3.3 RNA反转录 | 第52页 |
| 2.4 载体构建的一般方法 | 第52-57页 |
| 2.4.1 PCR扩增目的序列 | 第52-53页 |
| 2.4.2 PCR产物的琼脂糖凝胶纯化 | 第53页 |
| 2.4.3 载体及插入片段的酶切连接 | 第53-54页 |
| 2.4.4 质粒转化入大肠杆菌感受态细胞 | 第54页 |
| 2.4.5 碱裂法小提质粒 | 第54-55页 |
| 2.4.6 碱裂解法高纯度质粒大量提取 | 第55-57页 |
| 2.5 农杆菌介导的拟南芥转基因 | 第57-58页 |
| 2.5.1 农杆菌感受态的制备与转化 | 第57-58页 |
| 2.5.2 拟南芥转基因 | 第58页 |
| 2.6 荧光实时定量PCR | 第58-59页 |
| 2.7 染色体免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP) | 第59-63页 |
| 2.7.1 材料准备 | 第59页 |
| 2.7.2 细胞核提取 | 第59-60页 |
| 2.7.3 超声处理 | 第60页 |
| 2.7.4 Pre-clear与IP | 第60页 |
| 2.7.5 Wash与洗脱 | 第60-61页 |
| 2.7.6 解交联 | 第61-62页 |
| 2.7.7 DNA纯化 | 第62-63页 |
| 3 芜菁黄化花叶病毒P69引起寄主植物黄化症状的分子机制 | 第63-95页 |
| 3.1 材料与方法 | 第63-73页 |
| 3.1.1 植物材料 | 第63页 |
| 3.1.2 载体构建 | 第63-64页 |
| 3.1.3 酵母双杂交验证蛋白相互作用 | 第64-67页 |
| 3.1.3.1 载体的构建 | 第64页 |
| 3.1.3.2 酵母感受态的制作 | 第64-65页 |
| 3.1.3.3 酵母转化 | 第65页 |
| 3.1.3.4 阳性互作菌落筛选 | 第65-66页 |
| 3.1.3.5 酵母阳性菌落质粒提取 | 第66页 |
| 3.1.3.6 酵母质粒转化入大肠杆菌 | 第66-67页 |
| 3.1.3.7 大肠杆菌中cDNA文库质粒的PCR鉴定 | 第67页 |
| 3.1.3.8 cDNA序列的测定与分析 | 第67页 |
| 3.1.3.9 酵母的点滴培养 | 第67页 |
| 3.1.4 拟南芥原生质体转化与荧光观察 | 第67-69页 |
| 3.1.4.1 拟南芥原生质体制备和转化 | 第67-69页 |
| 3.1.4.2 荧光显微镜观察 | 第69页 |
| 3.1.5 双荧光素酶定量检测 | 第69-70页 |
| 3.1.6 拟南芥有性杂交 | 第70页 |
| 3.1.7 蛋白免疫沉淀 | 第70-71页 |
| 3.1.8 Western blot检测 | 第71-72页 |
| 3.1.9 RNA seq与数据分析 | 第72-73页 |
| 3.1.9.1 mRNA文库构建与测序 | 第72页 |
| 3.1.9.2 测序数据分析 | 第72-73页 |
| 3.2 结果与分析 | 第73-91页 |
| 3.2.1 转录因子GLK蛋白与TYMV P69蛋白相互作用的鉴定 | 第73-80页 |
| 3.2.1.1 与TYMV P69蛋白互作的拟南芥寄主因子的筛选 | 第73-74页 |
| 3.2.1.2 酵母双杂交验证TYMV P69蛋白与拟南芥GLK蛋白的相互作用并分析相互作用结构域 | 第74-75页 |
| 3.2.1.3 TYMV P69蛋白与拟南芥GLK蛋白的亚细胞定位分析 | 第75-77页 |
| 3.2.1.4 TYMV P69蛋白与拟南芥GLK蛋白的相互作用的亚细胞定位分析 | 第77-78页 |
| 3.2.1.5 免疫共沉淀验证在寄主植物体内TYMV P69蛋白与拟南芥GLK蛋白的相互作用 | 第78-80页 |
| 3.2.2 P69过表达的拟南芥具有与glk1glk2双突变体相似的表型 | 第80-84页 |
| 3.2.2.1 P69过表达的拟南芥与glk1glk2双突变体植株具有相似表型 | 第80-81页 |
| 3.2.2.2 P69过表达的拟南芥与glk1glk2双突变体叶绿体形态与叶绿素含量相似 | 第81-82页 |
| 3.2.2.3 P69过表达的拟南芥与glk1glk2双突变体叶绿体内部结构变化相似 | 第82-84页 |
| 3.2.3 P69过表达的拟南芥表现出与glk1glk2双突变体相似的转录图谱 | 第84-87页 |
| 3.2.3.1 P69过表达的拟南芥与glk1glk2双突变体中改变的基因 | 第84-85页 |
| 3.2.3.2 P69过表达的拟南芥与glk1glk2双突变体中改变的基因类型 | 第85-87页 |
| 3.2.4 P69通过阻碍GLK蛋白对其下游靶标基因启动子的结合抑制其转录活性 | 第87-91页 |
| 3.2.4.1 P69蛋白的存在使GLK蛋白下游靶标基因的转录水平降低 | 第87-89页 |
| 3.2.4.2 P69蛋白阻碍了GLK蛋白与其下游靶标基因启动子的结合 | 第89-91页 |
| 3.3 讨论 | 第91-95页 |
| 4 拟南芥NRPC7调控MIR基因转录的分子机制初探 | 第95-114页 |
| 4.1 材料与方法 | 第96-102页 |
| 4.1.0 植物材料 | 第96页 |
| 4.1.1 载体构建 | 第96页 |
| 4.1.2 突变体的筛选 | 第96-97页 |
| 4.1.2.1 amiR-triOX转基因系的构建 | 第96-97页 |
| 4.1.2.2 EMS诱变及筛选 | 第97页 |
| 4.1.3 基于全基因组重测序方法克隆突变体基因 | 第97-99页 |
| 4.1.3.1 建立克隆群体 | 第97页 |
| 4.1.3.2 建立全基因组重测序文库 | 第97-99页 |
| 4.1.3.3 测序数据的分析及验证 | 第99页 |
| 4.1.4 Northern blot检测miRNA的表达 | 第99-102页 |
| 4.1.4.1 植物sRNA的富集 | 第99-100页 |
| 4.1.4.2 sRNA的垂直板电泳 | 第100页 |
| 4.1.4.3 转膜 | 第100-101页 |
| 4.1.4.4 探针标记和杂交 | 第101页 |
| 4.1.4.5 洗膜和显影 | 第101-102页 |
| 4.2 结果与分析 | 第102-110页 |
| 4.2.1 建立amiR-triOX转基因系与突变体的筛选 | 第102-104页 |
| 4.2.1.1 amiR-triOX转基因系 | 第102页 |
| 4.2.1.2 ema与cma突变体的筛选 | 第102-104页 |
| 4.2.1.3 soe突变体的筛选 | 第104页 |
| 4.2.2 soe7突变体的分离及鉴定 | 第104-107页 |
| 4.2.3 soe7突变体对Pol Ⅲ转录活性的影响 | 第107-108页 |
| 4.2.4 soe7突变体影响部分miRNA的产生 | 第108-109页 |
| 4.2.5 NRPC7蛋白与MIR基因DNA分子相互作用的情况 | 第109-110页 |
| 4.3 讨论 | 第110-114页 |
| 5 全文小结 | 第114-115页 |
| 参考文献 | 第115-129页 |
| 附录A 本论文所用缩写词及中英文对照 | 第129-135页 |
| 附录B 本论文所用引物和探针 | 第135-142页 |
| 作者简历及攻读博士学位期间发表论文 | 第142页 |
