| 摘要 | 第1-6页 |
| Summary | 第6-11页 |
| 第一部分 文献综述 | 第11-30页 |
| 第一章 牛干扰素研究进展 | 第11-21页 |
| ·引言 | 第11页 |
| ·干扰素的产生与分类 | 第11-12页 |
| ·干扰素的分子结构 | 第12-15页 |
| ·牛干扰素的结构 | 第13页 |
| ·牛干扰素受体 | 第13-14页 |
| ·牛干扰素的信号转导途径 | 第14-15页 |
| ·干扰素的生物学活性及其作用机制 | 第15-18页 |
| ·相对的种属特异性 | 第15页 |
| ·微弱的抗原性 | 第15页 |
| ·高度的生物活性 | 第15-18页 |
| ·牦牛重组干扰素发展前景 | 第18-19页 |
| ·国内外研究现状 | 第19-21页 |
| ·干扰素研究现状 | 第19-20页 |
| ·牛干扰素的研究现状 | 第20-21页 |
| 第二章 外源基因在毕赤酵母中的表达 | 第21-30页 |
| ·巴斯德毕赤酵母(P. pastoris)表达系统及特点 | 第21-22页 |
| ·外源基因在 P. pastoris 中表达的影响因素及优化策略 | 第22-27页 |
| ·P. pastoris 表达载体的选择 | 第22-23页 |
| ·P. pastoris 宿主菌 | 第23页 |
| ·高效表达启动子 | 第23-24页 |
| ·信号肽及其选择 | 第24页 |
| ·P. pastoris 表达载体中的选择标记 | 第24-25页 |
| ·表达载体与P. pastoris 染色体的整合 | 第25-27页 |
| ·影响外源基因在P. pastoris 中表达的其他因素 | 第27-30页 |
| ·外源基因的内在特性 | 第27页 |
| ·表达条件的优化 | 第27-28页 |
| ·提高外源蛋白在毕赤酵母表达分泌过程中修饰和加工能力 | 第28-30页 |
| 第二部分 试验研究 | 第30-69页 |
| 第三章 牦牛干扰素-γ基因的克隆、表达及其蛋白纯化 | 第30-46页 |
| ·实验材料 | 第30-32页 |
| ·实验动物、菌种和载体 | 第30页 |
| ·酶和试剂 | 第30-31页 |
| ·培养基 | 第31页 |
| ·溶液 | 第31-32页 |
| ·仪器与设备 | 第32页 |
| ·实验方法 | 第32-40页 |
| ·牦牛外周血淋巴细胞的分离与培养 | 第32页 |
| ·淋巴细胞的刺激诱导 | 第32-33页 |
| ·总RNA 的提取 | 第33页 |
| ·RT-PCR 扩增目的片段 | 第33-34页 |
| ·目的基因的克隆 | 第34-35页 |
| ·重组质粒的提取与鉴定 | 第35-36页 |
| ·重组表达载体的构建 | 第36-38页 |
| ·重组菌的诱导表达、最佳表达条件的优化及SDS－PAGE 电泳分析 | 第38-39页 |
| ·纯化表达产物的检测 | 第39-40页 |
| ·结果 | 第40-44页 |
| ·淋巴细胞的体外刺激活化 | 第40-41页 |
| ·RNA 提取结果 | 第41页 |
| ·RT-PCR 产物 | 第41-42页 |
| ·重组克隆载体的鉴定 | 第42页 |
| ·牦牛IFN-γ序列测定及分析 | 第42页 |
| ·重组表达质粒的鉴定 | 第42-43页 |
| ·表达产物的检测 | 第43-44页 |
| ·讨论 | 第44-46页 |
| 第四章 牦牛Ⅰ型干扰素基因在毕赤酵母中的分泌表达 | 第46-57页 |
| ·材料和方法 | 第46-50页 |
| ·菌株与载体 | 第46页 |
| ·主要酶和试剂 | 第46页 |
| ·培养基 | 第46-47页 |
| ·仪器与设备 | 第47页 |
| ·pPIC9K-yakIFN-Ⅰ重组表达载体的构建 | 第47-48页 |
| ·重组表达载体pPIC9K-yakIFN-Ⅰ电转化毕赤酵母G5115 | 第48-50页 |
| ·重组酵母菌株的诱导表达 | 第50页 |
| ·表达产物的SDS-PAGE 分析 | 第50页 |
| ·表达的yakIFN-Ⅰ的纯化 | 第50页 |
| ·yakIFN-Ⅰ所编码蛋白糖基化及磷酸化位点预测 | 第50页 |
| ·结果 | 第50-55页 |
| ·重组载体pPIC9K-yakIFN-Ⅰ的构建及PCR 和双酶切鉴定 | 第50-52页 |
| ·重组酵母菌株 G5115/ pPIC9K- yakIFN-Ⅰ的鉴定 | 第52-53页 |
| ·摇床水平上重组酵母菌表达产物的SDS－PAGE 检测 | 第53-54页 |
| ·目的蛋白的纯化 | 第54-55页 |
| ·yakIFN-Ⅰ基因所编码蛋白糖基化及磷酸化位点预测 | 第55页 |
| ·讨论 | 第55-57页 |
| 第五章 重组牦牛干扰素的生物学活性分析 | 第57-68页 |
| ·实验材料 | 第57-58页 |
| ·实验细胞和病毒 | 第57页 |
| ·试剂 | 第57页 |
| ·溶液 | 第57-58页 |
| ·仪器与设备 | 第58页 |
| ·实验方法 | 第58-60页 |
| ·细胞的培养 | 第58页 |
| ·yakIFN-γ和yakIFN-Ⅰ重组蛋白促淋巴细胞转化 | 第58-59页 |
| ·PRV 病毒毒价测定 | 第59页 |
| ·重组yakIFN-γ和yakIFN-Ⅰ抗PRV 病毒活性分析 | 第59页 |
| ·yakIFN-γ抑制PRV 病毒诱导 MDBK 细胞调亡 | 第59-60页 |
| ·结果 | 第60-66页 |
| ·重组牦牛干扰素诱导淋巴细胞增殖 | 第60-62页 |
| ·PRV 病毒毒价的测定 | 第62页 |
| ·重组yakIFN 抗病毒活性测定 | 第62-66页 |
| ·干扰素抑制细胞凋亡试验结果 | 第66页 |
| ·分析与讨论 | 第66-68页 |
| 第六章 研究结论 | 第68-69页 |
| 参考文献 | 第69-75页 |
| 附录 | 第75-81页 |
| 致谢 | 第81-82页 |
| 作者简介 | 第82-83页 |
