| 摘要 | 第1-13页 |
| ABSTRACT | 第13-15页 |
| 技术路线 | 第15-16页 |
| 第一部分 文献综述 | 第16-33页 |
| 第一章 狂犬病病毒及狂犬病研究进展 | 第16-26页 |
| 1 狂犬病病毒属的分类 | 第16-17页 |
| 2 狂犬病病毒的形态与理化特征 | 第17页 |
| 3 狂犬病病毒的基因组及其结构蛋白 | 第17-21页 |
| ·糖蛋白 | 第18-19页 |
| ·核蛋白 | 第19-20页 |
| ·衣壳基质蛋白 | 第20页 |
| ·膜基质蛋白 | 第20页 |
| ·RNA聚合酶 | 第20-21页 |
| 4 狂犬病的流行病学 | 第21-22页 |
| ·全球流行状况 | 第21页 |
| ·中国狂犬病流行情况 | 第21-22页 |
| ·宿主与传染源 | 第22页 |
| ·传播途径 | 第22页 |
| 5 狂犬病的临床特征 | 第22-23页 |
| 6 RV抗体的检测 | 第23-26页 |
| ·快速荧光灶抑制实验 | 第23-24页 |
| ·荧光抗体病毒中和试验 | 第24页 |
| ·小鼠中和试验 | 第24页 |
| ·酶免疫吸附试验 | 第24-25页 |
| ·间接免疫荧光法 | 第25页 |
| ·胶体金免疫层析法 | 第25-26页 |
| 第二章 杆状病毒表达系统的研究进展 | 第26-33页 |
| 1 杆状病毒的生物学特性 | 第26-27页 |
| 2 杆状病毒载体表达系统的构建 | 第27页 |
| 3 家蚕/BMNPV表达系统的原理 | 第27-28页 |
| 4 重组杆状病毒的筛选方法 | 第28-29页 |
| ·空斑纯化 | 第28页 |
| ·NPV DNA线性化 | 第28-29页 |
| ·利用标志基因筛选 | 第29页 |
| ·BACMID系统 | 第29页 |
| ·其它方法 | 第29页 |
| 5 影响外源蛋白表达量的因素 | 第29-31页 |
| ·外源基因及其编码产物性质 | 第29-30页 |
| ·病毒的稳定性 | 第30页 |
| ·启动子的特性 | 第30页 |
| ·转移载体 | 第30页 |
| ·表达宿主 | 第30-31页 |
| 6 杆状病毒表达载体的优点 | 第31页 |
| 7 家蚕杆状病毒表达系统的优点 | 第31-33页 |
| 第二部分 研究内容 | 第33-75页 |
| 第一章 BAC-TO-BAC/ACMNPV杆状病毒表达系统表达狂犬病病毒核蛋白 | 第33-50页 |
| 摘要 | 第33-34页 |
| 1 材料 | 第34页 |
| ·病毒、菌种、细胞和载体 | 第34页 |
| ·工具酶及试剂 | 第34页 |
| 2 方法 | 第34-44页 |
| ·狂犬病病毒N基因的克隆 | 第34-37页 |
| ·RT-PCR引物的设计与合成 | 第34页 |
| ·病毒基因组RNA的抽提 | 第34-35页 |
| ·RT | 第35页 |
| ·PCR | 第35页 |
| ·PCR产物割胶回收纯化 | 第35页 |
| ·连接 | 第35-36页 |
| ·感受态细胞制备(CaCl_2法) | 第36页 |
| ·NP-pMD-18T载体质粒转化大肠杆菌TOP10感受态细胞 | 第36页 |
| ·NP-pMD-18T载体质粒转化子筛选和鉴定 | 第36页 |
| ·目的基因的双酶切 | 第36-37页 |
| ·回收NP酶切片段 | 第37页 |
| ·重组转移载体PFASTBACHTB-NP的构建 | 第37-38页 |
| ·杆状病毒转移载体pFastBacHTB质粒的制备 | 第37页 |
| ·pFastBacHTB表达载体的双酶切 | 第37-38页 |
| ·目的基因与杆状病毒载体的连接 | 第38页 |
| ·重组转移载体的转化 | 第38页 |
| ·重组转移载体的鉴定 | 第38页 |
| ·重组RBACMID/BMNPV/NP质粒的制备和鉴定 | 第38-40页 |
| ·重组rBacmid/BmNPV/NP质粒的制备 | 第38-39页 |
| ·重组rBacmid/BmNPV/NP的提取和鉴定 | 第39-40页 |
| ·重组病毒的获得及鉴定 | 第40-41页 |
| ·sf9细胞的复苏、代传 | 第40页 |
| ·rBacmid/BmNPV/NP的转染 | 第40-41页 |
| ·重组病毒的PCR鉴定 | 第41页 |
| ·目的蛋白的表达与鉴定 | 第41-44页 |
| ·重组杆状病毒的滴度测定 | 第41页 |
| ·重组杆状病毒的扩增 | 第41-42页 |
| ·间接免疫荧光实验(IFA) | 第42页 |
| ·目的蛋白表达的SDS-PAGE分析 | 第42页 |
| ·目的蛋白表达的Western-blot检测 | 第42-43页 |
| ·重组蛋白的纯化标准程序探索 | 第43-44页 |
| 3 结果 | 第44-48页 |
| ·ERA株核蛋白基因的RT-PCR扩增结果 | 第44页 |
| ·T载体重组质粒NP-PMD-18T的PCR鉴定 | 第44-45页 |
| ·转移载体的构建及鉴定 | 第45页 |
| ·重组RBACMID/ACNPV/NP质粒的提取和鉴定 | 第45-46页 |
| ·细胞转染结果 | 第46-47页 |
| ·重组蛋白的IFA检测结果 | 第47-48页 |
| ·SDS-PAGE与WESTERN BLOT分析核蛋白的表达 | 第48页 |
| 4 讨论 | 第48-50页 |
| 第二章 BAC-TO-BAC/BMNPV杆状病毒表达系统表达狂犬病毒N蛋白 | 第50-60页 |
| 摘要 | 第50页 |
| 1 材料 | 第50-51页 |
| 2 方法 | 第51-54页 |
| ·重组转移载体的构建及鉴定 | 第51页 |
| ·重组BACMID质粒的制备和鉴定 | 第51页 |
| ·重组病毒的获得及鉴定 | 第51页 |
| ·rBacmid/BmNPV/NP的转染 | 第51页 |
| ·重组病毒的PCR鉴定 | 第51页 |
| ·目的蛋白的表达与鉴定 | 第51-54页 |
| ·重组杆状病毒的滴度测定 | 第51页 |
| ·重组杆状病毒的扩增 | 第51-52页 |
| ·间接免疫荧光试验(IFA) | 第52页 |
| ·重组核蛋白在家蚕细胞上的大量表达 | 第52页 |
| ·重组核蛋白在家蚕上的大量表达 | 第52-53页 |
| ·目的蛋白表达的SDS-PAGE分析 | 第53页 |
| ·目的蛋白表达的Western-blot检测 | 第53页 |
| ·重组核蛋白的亲和层析纯化 | 第53-54页 |
| 3 结果 | 第54-58页 |
| ·重组RBACMID/BMNPV/NP的提取和鉴定 | 第54-55页 |
| ·细胞转染结果 | 第55-56页 |
| ·重组蛋白的IFA检测结果 | 第56页 |
| ·重组核蛋白在家蚕上的大量表达 | 第56-57页 |
| ·重组蛋白表达的SDS-PAGE分析 | 第57-58页 |
| 4 讨论 | 第58-60页 |
| 第三章 犬狂犬病病毒抗体BMNPV-NP-ELISA标准检测体系的建立 | 第60-75页 |
| 摘要 | 第60页 |
| 1 材料 | 第60-61页 |
| ·主要试剂与仪器 | 第60-61页 |
| ·血清 | 第61页 |
| 2 方法 | 第61-66页 |
| ·ELISA抗原制备 | 第61页 |
| ·重组RV核蛋白 | 第61页 |
| ·RV病毒抗原的制备 | 第61页 |
| ·ELISA的操作基本程序 | 第61-62页 |
| ·BMNPV-NP-ELISA最佳反应条件的建立 | 第62-63页 |
| ·抗原包被浓度和血清最佳稀释倍数的确定 | 第62页 |
| ·包被液的选择 | 第62页 |
| ·封闭液的选择 | 第62页 |
| ·稀释液的选择 | 第62-63页 |
| ·血清最佳反应时间的确定 | 第63页 |
| ·酶标抗体反应时间的确定 | 第63页 |
| ·TMB底物反应时间的确定 | 第63页 |
| ·间接ELISA判定标准的确定 | 第63页 |
| ·敏感性试验 | 第63页 |
| ·重复性试验 | 第63-64页 |
| ·同批抗原包被批内重复性试验 | 第63-64页 |
| ·不同批次抗原包被板间重复性试验 | 第64页 |
| ·有效性试验 | 第64-66页 |
| ·与IFA的比较 | 第64页 |
| ·与狂犬病病毒ELISA(RV-ELISA)的比较 | 第64页 |
| ·与pETNP-ELISA的比较 | 第64-65页 |
| ·与AcNPV-NP-ELISA的比较 | 第65页 |
| ·与进口ELISA试剂盒的比较 | 第65-66页 |
| 3 结果 | 第66-73页 |
| ·RV病毒抗原的制备与纯化 | 第66页 |
| ·间接ELISA最佳反应条件的建立 | 第66-69页 |
| ·重组蛋白抗原最适包被浓度与血清稀释度的确定 | 第66-68页 |
| ·包被液的选择 | 第68页 |
| ·封闭液的选择 | 第68页 |
| ·稀释液的选择 | 第68页 |
| ·血清最佳反应时间的确定 | 第68页 |
| ·酶标抗体反应时间的确定 | 第68-69页 |
| ·TMB底物反应时间的确定 | 第69页 |
| ·间接ELISA判定标准的确定 | 第69页 |
| ·间接ELISA敏感性试验 | 第69页 |
| ·重复性试验 | 第69-70页 |
| ·同批抗原包被批内重复性试验 | 第69-70页 |
| ·批间重复性试验 | 第70页 |
| ·有效性试验 | 第70-73页 |
| ·与IFA的比较 | 第70-71页 |
| ·与病毒ELISA(RV-ELISA)的比较 | 第71页 |
| ·与pETNP-ELISA的比较 | 第71页 |
| ·与美国SYNBIOTICS狂犬病抗体检测试剂盒的比较 | 第71-72页 |
| ·与AcNPV-NP-ELISA的比较 | 第72页 |
| ·各种间接ELISA与进口试剂盒的对比实验 | 第72-73页 |
| 4 讨论 | 第73-75页 |
| 参考文献 | 第75-84页 |
| 附录A 常用缓冲液及培养基配方 | 第84-90页 |
| 学习期间发表或录用的学术论文 | 第90-91页 |
| 致谢 | 第91页 |
