| 摘要 | 第1-11页 |
| ABSTRACT | 第11-12页 |
| 第一部分 文献综述 | 第12-34页 |
| 1 猪圆环病毒的一般生物学特征 | 第13-15页 |
| ·猪圆环病毒的发现和分类 | 第13-14页 |
| ·PCV的形态和理化特性 | 第14页 |
| ·PCV的培养特性 | 第14-15页 |
| 2 猪圆环病毒的分子生物学特征 | 第15-17页 |
| ·PCV分子结构特征 | 第15-16页 |
| ·PCV基因组主要编码蛋白 | 第16-17页 |
| 3 PCV的诊断 | 第17-22页 |
| ·临床诊断 | 第17-18页 |
| ·病理学诊断 | 第18-19页 |
| ·实验室诊断 | 第19-22页 |
| ·电镜法 | 第19页 |
| ·间接免疫荧光(IFA) | 第19页 |
| ·免疫组化试验(IHC) | 第19页 |
| ·酶联免疫吸附试验(ELISA) | 第19-20页 |
| ·免疫过氧化物酶单层细胞实验技术 | 第20页 |
| ·聚合酶链反应技术 | 第20-22页 |
| ·常规PCR | 第21页 |
| ·套式PCR(Nested-PCR) | 第21页 |
| ·多重PCR(multiplex PCR) | 第21页 |
| ·实时荧光定量PCR | 第21-22页 |
| ·核酸杂交技术 | 第22页 |
| ·限制性长度多态性分析(RFLP) | 第22页 |
| 4 免疫胶体金技术 | 第22-29页 |
| ·免疫胶体金技术原理 | 第23-24页 |
| ·胶体金 | 第24页 |
| ·免疫胶体金技术的研究进展 | 第24-29页 |
| ·免疫胶体金技术生物医学方面的应用 | 第25-29页 |
| ·免疫胶体金技术在食品卫生方面的应用 | 第25-26页 |
| ·免疫胶体金技术在植物学上的应用 | 第26-27页 |
| ·免疫胶体金技术在兽医上的应用 | 第27-29页 |
| ·免疫胶体金技术在家禽疾病上的应用 | 第27页 |
| ·免疫胶体金技术在家畜疾病上的应用 | 第27-28页 |
| ·免疫胶体金技术在犬病诊断上的应用 | 第28-29页 |
| 参考文献 | 第29-34页 |
| 第二部分 研究内容 | 第34-84页 |
| 第一章 猪圆环病毒2分子生物学检测方法的建立 | 第34-52页 |
| 1 材料 | 第35-36页 |
| ·细胞株 | 第35页 |
| ·病毒株 | 第35页 |
| ·生化试剂 | 第35页 |
| ·主要仪器 | 第35-36页 |
| 2 方法 | 第36-40页 |
| ·TCID_(50)的测定 | 第36页 |
| ·病毒的稀释与再分离 | 第36页 |
| ·病毒DNA的抽提 | 第36-37页 |
| ·普通PCR检测 | 第37-38页 |
| ·PCV2特异性检测引物的设计 | 第37页 |
| ·普通PCR的反应体系与程序 | 第37-38页 |
| ·荧光定量PCR对病毒样品进行绝对定量 | 第38-39页 |
| ·荧光定量PCR引物的设计 | 第38页 |
| ·荧光定量PCR的体系与程序 | 第38页 |
| ·阳性标准模板的制备 | 第38-39页 |
| ·数据分析 | 第39页 |
| ·免疫荧光检测细胞培养的PCV2抗原 | 第39-40页 |
| 3 结果 | 第40-50页 |
| ·TCID_(50)的测定、病毒液稀释 | 第40页 |
| ·PCV2特异性引物的检测 | 第40-41页 |
| ·常规PCR检测 | 第41-43页 |
| ·qPCR绝对定量PCV2病毒拷贝数 | 第43-46页 |
| ·阳性标准模板的制备 | 第43页 |
| ·荧光定量PCR引物的特异性 | 第43-44页 |
| ·荧光定量PCR引物的扩增效率 | 第44-45页 |
| ·病毒拷贝数与TCID_(50)二者之间的关系 | 第45-46页 |
| ·病毒分离可检测的最低病毒滴度 | 第46-48页 |
| ·PCR、qPCR、病毒分离检测灵敏度的比较 | 第48-50页 |
| 4 讨论 | 第50页 |
| 参考文献 | 第50-52页 |
| 第二章 猪圆环病毒胶体金免疫层析技术的建立 | 第52-84页 |
| 1.材料 | 第53-54页 |
| ·毒株 | 第53页 |
| ·细胞 | 第53页 |
| ·猪阳性血清以及PCV1、PCV2特异性单克隆抗体 | 第53-54页 |
| ·实验动物 | 第54页 |
| ·试剂与耗材 | 第54页 |
| 2 方法 | 第54-67页 |
| ·PCV2-Cap蛋白构象性表位的鉴定 | 第54-57页 |
| ·引物设计 | 第54-55页 |
| ·核苷酸序列的扩增与纯化 | 第55页 |
| ·真核表达载体的构建 | 第55-56页 |
| ·构建真核表达重组质粒 | 第55-56页 |
| ·重组质粒的鉴定 | 第56页 |
| ·PCV2-Cap蛋白构象性表位的初步确定 | 第56-57页 |
| ·体外转染试验 | 第56-57页 |
| ·免疫过氧化物酶单层试验(IPMA) | 第57页 |
| ·单克隆抗体的筛选 | 第57-58页 |
| ·单克隆抗体细胞的培养 | 第58页 |
| ·单克隆抗体腹水的制备 | 第58-59页 |
| ·单克隆抗体的效价的测定 | 第59页 |
| ·单克隆抗体与猪多抗IgG的分离与纯化 | 第59-62页 |
| ·样品的粗提饱和正辛酸—硫酸铵法(CA-AS) | 第59-60页 |
| ·IgG的纯化·亲和层析 | 第60-61页 |
| ·IgG的定量与SDS-PAGE凝胶电泳鉴定 | 第61-62页 |
| ·金标用IgG脱盐处理 | 第62页 |
| ·纯化后的IgG的ELISA效价测定 | 第62页 |
| ·胶体金的制备与鉴定 | 第62-63页 |
| ·胶体金-IgG复合物的制备 | 第63-64页 |
| ·待标记物最佳标记浓度的确定 | 第63页 |
| ·胶体金与IgG结合 | 第63-64页 |
| ·试纸条制备耗材的筛选 | 第64-65页 |
| ·硝酸纤维素膜的筛选 | 第64-65页 |
| ·胶体金快速诊断试纸条的制备、组装 | 第65-66页 |
| ·胶体金快速诊断试纸条的检测 | 第66-67页 |
| ·可用性检测 | 第66-67页 |
| ·特异性检测 | 第67页 |
| ·灵敏度检测 | 第67页 |
| ·稳定性检测 | 第67页 |
| 3 结果 | 第67-81页 |
| ·PCV2-Cap蛋白构象性表位的确定 | 第67-69页 |
| ·PCV2-Cap蛋白短肽核苷酸的克隆 | 第67-68页 |
| ·构建真核表达载体 | 第68页 |
| ·初步确定PCV2-ORF2构象性表位 | 第68-69页 |
| ·体外转染试验 | 第68页 |
| ·PCV2-ORF2构象性表位的鉴定 | 第68-69页 |
| ·特异性单克隆抗体的筛选 | 第69-71页 |
| ·单克隆抗体细胞的培养与腹水制备、效价测定 | 第71-72页 |
| ·单克隆抗体与猪多克隆抗体的纯化与检测 | 第72-74页 |
| ·胶体金的制备 | 第74页 |
| ·胶体金与IgG结合 | 第74-75页 |
| ·胶体金与5E11-IgG的结合 | 第74-75页 |
| ·胶体金与6H9-IgG的结合 | 第75页 |
| ·胶体金与8Al2-IgG、3F11-IgG的结合 | 第75页 |
| ·硝酸纤维素膜的筛选 | 第75-76页 |
| ·试纸条的制备 | 第76-77页 |
| ·鉴别PCV试纸条的制备 | 第76页 |
| ·鉴别~(1768)PCV2病毒试纸条的制备 | 第76页 |
| ·鉴别~(1767)PCV2病毒试纸条的制备 | 第76-77页 |
| ·鉴别PCV1病毒试纸条的制备 | 第77页 |
| ·试纸条的检测 | 第77-81页 |
| ·可用性检测 | 第77-79页 |
| ·特异性检测 | 第79页 |
| ·灵敏度检测 | 第79-80页 |
| ·稳定性检测 | 第80-81页 |
| 4 讨论 | 第81-82页 |
| 参考文献 | 第82-84页 |
| 附录一 常用缓冲液及培养基配方 | 第84-90页 |
| 附录二 攻读硕士期间研究成果 | 第90-91页 |
| 致谢 | 第91页 |