| 摘要 | 第4-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 引言 | 第10-18页 |
| 1 植物耐寒研究进展 | 第10-13页 |
| 1.1 低温胁迫下植物形态特征及显微结构变化研究 | 第10-11页 |
| 1.1.1 低温胁迫下的形态特征变化研究 | 第10页 |
| 1.1.2 低温胁迫下的显微结构变化研究 | 第10-11页 |
| 1.2 低温胁迫下植物生理生化研究 | 第11-12页 |
| 1.3 低温胁迫下植物响应机理以及反应研究 | 第12-13页 |
| 2 木薯低温响应研究进展 | 第13-14页 |
| 3 类受体蛋白激酶的研究进展 | 第14-16页 |
| 4 本文研究的目的与意义 | 第16-17页 |
| 5 技术路线 | 第17-18页 |
| 材料与方法 | 第18-35页 |
| 1 材料与试剂 | 第18-20页 |
| 1.1 实验材料 | 第18页 |
| 1.2 菌株与载体 | 第18页 |
| 1.3 主要药品及试剂 | 第18-19页 |
| 1.4 培养基及添加成分 | 第19页 |
| 1.5 主要仪器设备 | 第19-20页 |
| 2 实验方法 | 第20-35页 |
| 2.1 RNA提取 | 第20页 |
| 2.2 反转录反应 | 第20-21页 |
| 2.3 第一链cDNA检测 | 第21-22页 |
| 2.4 MeCRLK1基因的克隆分离 | 第22-25页 |
| 2.4.1 引物设计 | 第22页 |
| 2.4.2 PCR反应体系及条件 | 第22页 |
| 2.4.3 PCR产物回收 | 第22-23页 |
| 2.4.4 回收产物加尾及连接T载体 | 第23页 |
| 2.4.5 大肠杆菌感受态的制备 | 第23页 |
| 2.4.6 重组产物的转化 | 第23-24页 |
| 2.4.7 阳性质粒克隆检测 | 第24页 |
| 2.4.8 重组DNA质粒的提取 | 第24-25页 |
| 2.5 MeCRLK1基因生物信息学分析 | 第25页 |
| 2.6 MeCRLK1基因表达分析 | 第25-27页 |
| 2.6.1 胁迫处理总RNA提取反转录 | 第25-26页 |
| 2.6.2 QRT-PCR引物的特异性验证 | 第26页 |
| 2.6.3 相对表达量的计算 | 第26-27页 |
| 2.7 MeCRLK1基因亚细胞定位分析 | 第27-28页 |
| 2.7.1 MeCRLK1基因亚细胞定位载体构建 | 第27页 |
| 2.7.2 农杆菌感受态制备 | 第27-28页 |
| 2.7.3 质粒DNA转化农杆菌感受态 | 第28页 |
| 2.7.4 MeCRLK1在烟草中亚细胞定位 | 第28页 |
| 2.7.5 激光共聚焦显微镜下检测 | 第28页 |
| 2.8 MeCRLK1基因在拟南芥中的耐寒生理生化分析 | 第28-30页 |
| 2.8.1 拟南芥植物培养 | 第28-29页 |
| 2.8.2 拟南芥浸染转化 | 第29页 |
| 2.8.3 拟南芥DNA的提取 | 第29-30页 |
| 2.8.4 MeCRLK1转基因拟南芥的耐寒性分析 | 第30页 |
| 2.9 MeCRLK1启动子顺式作用元件分析 | 第30-31页 |
| 2.10 MeCRLK1基因在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达及耐寒性功能分析 | 第31-35页 |
| 2.10.1 重组MeCRLK1在大肠杆菌表达载体构建 | 第31页 |
| 2.10.2 重组质粒DNA检测 | 第31-32页 |
| 2.10.3 重组MeCRLK1大肠杆菌表达菌的构建 | 第32页 |
| 2.10.4 MeCRLK1重组大肠杆菌的诱导表达 | 第32页 |
| 2.10.5 重组MeCRLK1大肠杆菌表达菌组的诱导表达条件优化 | 第32-33页 |
| 2.10.6 重组MeCRLK1大肠杆菌GST蛋白的原核表达以及提纯 | 第33-35页 |
| 实验结果及分析 | 第35-52页 |
| 1 MeCRLK基因克隆鉴定及生物信息学分析 | 第35-42页 |
| 1.1 木薯总RNA的提取 | 第35-36页 |
| 1.2 MeCRLK1基因克隆 | 第36-37页 |
| 1.3 MeCRLK1理化性质分析 | 第37页 |
| 1.4 MeCRLK1磷酸化预测 | 第37-38页 |
| 1.5 CaM结合位点预测 | 第38-40页 |
| 1.6 MeCRLK1亚细胞定位、跨膜区和信号肽分析 | 第40页 |
| 1.7 MeCRLK1蛋白固有无序化区、球蛋白区预测 | 第40-41页 |
| 1.8 木薯MeCRLK1与拟南芥AtCRLK1氨基酸序列比对 | 第41-42页 |
| 2 MeCRLK1基因表达分析 | 第42-43页 |
| 2.1 低温胁迫下MeCRLK1基因的表达分析 | 第42-43页 |
| 3 MeCRLK1基因亚细胞定位分析 | 第43-46页 |
| 3.1 MeCRLK1基因与GFP融合表达载体的构建与鉴定 | 第43-44页 |
| 3.2 MeCRLK1基因在烟草表皮细胞中的定位 | 第44-46页 |
| 4 MeCRLK1基因在拟南芥中的功能分析 | 第46-52页 |
| 4.1 转基因拟南芥的鉴定 | 第46-47页 |
| 4.2 转基因拟南芥生理生化耐寒性分析 | 第47-52页 |
| 4.2.1 表型分析 | 第47-49页 |
| 4.2.2 生理指标分析 | 第49-52页 |
| 5 MeCRLK1基因在大肠杆菌BL21 (DE3)中的表达及蛋白提取 | 第52-59页 |
| 5.1 重组MeCRLK1大肠杆菌表达载体的构建及BL21(DE3)工程菌制备 | 第52页 |
| 5.2 重组MeCRLK1大肠杆菌表达工程菌诱导表达 | 第52-53页 |
| 5.3 重组MeCRLK1大肠杆菌表达工程菌诱导条件优化 | 第53-57页 |
| 5.3.1 重组基因IPTG诱导浓度不同的优化 | 第53-54页 |
| 5.3.2 起始浓度OD_(600)值不同的诱导优化 | 第54-55页 |
| 5.3.3 重组MeCRLK1基因工程菌温度不同的优化 | 第55-56页 |
| 5.3.4 时间不同的诱导优化 | 第56-57页 |
| 5.4 重组MeCRLK1大肠杆菌表达工程菌蛋白提纯 | 第57-59页 |
| 讨论 | 第59-62页 |
| 结论 | 第62-63页 |
| 参考文献 | 第63-70页 |
| 附录 | 第70-71页 |
| 个人简历 | 第71-72页 |
| 硕士在读期间撰写及发表的论文 | 第72-73页 |
| 致谢 | 第73页 |
