| 摘要 | 第8-10页 |
| Abstract | 第10-11页 |
| 第一章 文献综述 | 第14-23页 |
| 1 MDRV研究进展 | 第14-19页 |
| 1.1 MDRV感染 | 第14-15页 |
| 1.2 MDRV的特性 | 第15-19页 |
| 1.3 诊断方法研究进展 | 第19页 |
| 2 MDRV诱导细胞凋亡的研究进展 | 第19-21页 |
| 3 MDRV调控细胞周期的研究进展 | 第21-22页 |
| 4 本研究的目的与意义 | 第22-23页 |
| 第二章 MDRV-p10蛋白的原核表达及兔抗多克隆抗体的制备 | 第23-45页 |
| 1 材料与方法 | 第23-33页 |
| 1.1 材料 | 第23-25页 |
| 1.1.1 (毒、菌)株、实验动物及表达载体 | 第23页 |
| 1.1.2 主要试剂 | 第23-24页 |
| 1.1.3 主要实验仪器 | 第24-25页 |
| 1.2 试验方法 | 第25-33页 |
| 1.2.1 引物的设计与合成 | 第25页 |
| 1.2.2 MDRV-YB p10基因的扩增 | 第25-26页 |
| 1.2.3 重组表达质粒的构建与鉴定 | 第26-29页 |
| 1.2.4 MDRV-YB p10基因的序列分析 | 第29页 |
| 1.2.5 重组质粒pET-p10-YB在E.coli BL21 (DE3)中的诱导表达 | 第29-30页 |
| 1.2.6 32a-p10蛋白的SDS-PAGE电泳分析 | 第30页 |
| 1.2.7 32a-p10蛋白诱导表达体系优化 | 第30-31页 |
| 1.2.8 32a-p10蛋白的纯化及蛋白浓度测定 | 第31页 |
| 1.2.9 32a-p10蛋白的Western blot鉴定 | 第31页 |
| 1.2.10 兔抗32a-p10蛋白多克隆抗体的制备及鉴定 | 第31-33页 |
| 2 结果与分析 | 第33-42页 |
| 2.1 MDRV-YB p10基因的RT-PCR扩增结果 | 第33页 |
| 2.2 重组表达质粒的鉴定结果 | 第33-35页 |
| 2.3 测序结果及序列分析结果 | 第35-36页 |
| 2.3.1 核苷酸序列分析 | 第35页 |
| 2.3.2 蛋白序列分析结果 | 第35-36页 |
| 2.4 诱导的32a-p10蛋白的SDS-PAGE分析结果 | 第36-37页 |
| 2.5 32a-p10蛋白诱导表达条件的优化结果 | 第37-39页 |
| 2.5.1 IPTG最佳诱导温度的优化 | 第37-38页 |
| 2.5.2 IPTG最佳诱导时间的优化 | 第38页 |
| 2.5.3 IPTG最佳诱导浓度的优化 | 第38-39页 |
| 2.6 32a-p10蛋白的Ni-NTA亲和层析纯化结果 | 第39-40页 |
| 2.7 32a-p10蛋白的Western-blot鉴定结果 | 第40-41页 |
| 2.8 兔抗32a-p10血清效价的检测结果 | 第41-42页 |
| 2.9 兔抗32a-p10多克隆抗体的Western-blot鉴定结果 | 第42页 |
| 3 讨论 | 第42-45页 |
| 第三章 MDRV-p10蛋白真核表达载体的构建及其在DF-1细胞中的表达 | 第45-58页 |
| 1 材料与方法 | 第45-51页 |
| 1.1 材料 | 第45-46页 |
| 1.1.1 质粒、载体和细胞 | 第45页 |
| 1.1.2 主要试验试剂 | 第45-46页 |
| 1.1.3 主要仪器设备 | 第46页 |
| 1.2 方法 | 第46-51页 |
| 1.2.1 引物的设计与合成 | 第46-47页 |
| 1.2.2 MDRV-YB p10基因的扩增 | 第47页 |
| 1.2.3 重组真核表达质粒的构建与鉴定 | 第47-48页 |
| 1.2.4 DF-1细胞(鸡成纤维细胞)的复苏及传代培养 | 第48-49页 |
| 1.2.5 pCI-neo-p10重组质粒转染DF-1细胞 | 第49页 |
| 1.2.6 MDRV-YB p10基因在DF-1细胞内mRNA水平变化的检测 | 第49-50页 |
| 1.2.7 间接免疫荧光试验检测p10蛋白在DF-1细胞内的表达 | 第50-51页 |
| 1.2.8 Flag-p10蛋白的Western-blot分析 | 第51页 |
| 1.2.9 统计学处理 | 第51页 |
| 2 结果与分析 | 第51-55页 |
| 2.1 MDRV-YB p10基因的扩增 | 第51页 |
| 2.2 pCI-neo-p10重组真核表达质粒的鉴定结果 | 第51-53页 |
| 2.3 RT-PCR检测重组p10基因在DF-1细胞上mRNA转录水平 | 第53页 |
| 2.4 间接免疫荧光检测p10蛋白在DF-1细胞内的表达 | 第53-54页 |
| 2.5 Flag-p10蛋白的Western blot结果分析 | 第54-55页 |
| 3 讨论 | 第55-58页 |
| 第四章 MDRV-p10蛋白的生物学功能探索 | 第58-66页 |
| 1 材料与方法 | 第58-60页 |
| 1.1 材料 | 第58-59页 |
| 1.1.1 质粒和细胞 | 第58页 |
| 1.1.2 主要试剂 | 第58页 |
| 1.1.3 主要仪器设备 | 第58-59页 |
| 1.2 方法 | 第59-60页 |
| 1.2.1 流式细胞术检测DF-1细胞凋亡率和细胞周期 | 第59-60页 |
| 1.2.2 Western blot检测Fas介导的细胞凋亡和p53介导的细胞周期信号通路相关蛋白指标 | 第60页 |
| 2 结果与分析 | 第60-63页 |
| 2.1 流式细胞术检测DF-1细胞凋亡率结果分析 | 第60-62页 |
| 2.2 Fas介导的死亡受体途径相关蛋白的Western blot分析 | 第62页 |
| 2.3 p53介导的细胞周期信号通路相关蛋白的Western blot分析 | 第62-63页 |
| 3 讨论 | 第63-66页 |
| 第五章 结论 | 第66-67页 |
| 致谢 | 第67-68页 |
| 参考文献 | 第68-74页 |
| 附录 | 第74-78页 |
