| 摘要 | 第1-4页 |
| ABSTRACT | 第4-10页 |
| 第一章 前言 | 第10-19页 |
| ·米曲霉 | 第10页 |
| ·米曲霉蛋白酶研究进展 | 第10-11页 |
| ·米曲霉的基因组 | 第10-11页 |
| ·蛋白水解酶 | 第11页 |
| ·蛋白酶改造的方法 | 第11-18页 |
| ·蛋白酶改造的传统方法 | 第13页 |
| ·蛋白质的体外进化 | 第13-17页 |
| ·展望 | 第17-18页 |
| ·研究的目的、内容和意义 | 第18-19页 |
| 第二章 米曲霉蛋白酶基因在大肠杆菌中的克隆表达 | 第19-41页 |
| ·材料、仪器与试剂 | 第19-22页 |
| ·材料 | 第19-20页 |
| ·主要仪器 | 第20页 |
| ·主要试剂 | 第20-22页 |
| ·方法 | 第22-32页 |
| ·从米曲霉固态发酵物中提取总RNA | 第22-23页 |
| ·引物设计 | 第23页 |
| ·cDNA第一链合成 | 第23页 |
| ·米曲霉蛋白酶基因PCR扩增 | 第23-24页 |
| ·DNA片断的纯化 | 第24-25页 |
| ·基因的TA克隆 | 第25页 |
| ·表达载体6HisT-pRX2质粒提取(CH_3COONH_4法) | 第25-26页 |
| ·表达载体6HisT-pRX2和目的基因双酶切 | 第26页 |
| ·目的基因与原核表达载体6HisT-pRX2连接 | 第26-27页 |
| ·大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备 | 第27页 |
| ·转化E.coli DH5α感受态细胞 | 第27页 |
| ·阳性克隆的筛选与鉴定 | 第27-28页 |
| ·重组质粒转化E.coli BL21 | 第28页 |
| ·6HisT-pRX2-NIP和6HisT-pRX2-ALP融合蛋白的诱导表达 | 第28-29页 |
| ·表达蛋白的SDS-PAGE分析 | 第29-30页 |
| ·重组蛋白的纯化 | 第30页 |
| ·Ni-NTA His.Bind Resin再生 | 第30页 |
| ·蛋白酶活力的测定 | 第30-32页 |
| ·结果 | 第32-38页 |
| ·RNA提取结果 | 第32页 |
| ·PCR扩增结果 | 第32-33页 |
| ·TA克隆质粒测序结果 | 第33页 |
| ·表达载体的构建 | 第33-35页 |
| ·重组质粒在大肠杆菌中诱导表达及可溶性分析 | 第35-36页 |
| ·重组蛋白的活力测定和纯化 | 第36-38页 |
| ·讨论与结论 | 第38-41页 |
| ·讨论 | 第38-39页 |
| ·结论 | 第39-41页 |
| 第三章 米曲霉蛋白酶基因在毕赤酵母中的克隆与表达 | 第41-55页 |
| ·材料 | 第41-42页 |
| ·菌种和质粒 | 第41页 |
| ·主要试剂及溶液 | 第41-42页 |
| ·方法 | 第42-45页 |
| ·引物设计 | 第42-43页 |
| ·表达载体pPIC9K-NIPJT,和pPIC9K-ALPZT的构建 | 第43页 |
| ·毕赤酵母GS115的电转法转化与鉴定 | 第43-44页 |
| ·酵母重组子的摇瓶诱导表达与分析 | 第44-45页 |
| ·结果 | 第45-53页 |
| ·alp基因信号肽序列连接PCR结果 | 第45-46页 |
| ·nip基因,alp基因毕赤酵母表达载体的构建 | 第46-50页 |
| ·毕赤酵母重组子的诱导表达及活力测定 | 第50-51页 |
| ·SDS-PAGE电泳分析 | 第51-53页 |
| ·讨论与结论 | 第53-55页 |
| ·讨论 | 第53-54页 |
| ·结论 | 第54-55页 |
| 第四章 结论与展望 | 第55-56页 |
| ·结论 | 第55页 |
| ·展望 | 第55-56页 |
| 参考文献 | 第56-60页 |
| 攻读学位期间的研究成果 | 第60页 |
| 个人简介 | 第60-61页 |
| 致谢 | 第61页 |
