| 摘要 | 第5-7页 |
| abstract | 第7-8页 |
| 第一章 绪论 | 第14-22页 |
| 1.1 卤醇脱卤酶简介及研究现状 | 第14页 |
| 1.2 卤醇脱卤酶的晶体结构及催化机制 | 第14-16页 |
| 1.3 卤醇脱卤酶催化反应的动力学特性 | 第16-18页 |
| 1.3.1 稳态动力学 | 第16页 |
| 1.3.2 瞬态动力学 | 第16-17页 |
| 1.3.3 停流荧光和快速淬灭方法 | 第17页 |
| 1.3.4 蛋白质的内源荧光在动力学研究中的应用 | 第17-18页 |
| 1.4 蛋白质的重新设计及其在生物催化中的应用 | 第18-20页 |
| 1.4.1 蛋白质工程在酶底物特异性以及活性提高中的应用 | 第18-19页 |
| 1.4.2 提高或者逆转酶的对映体选择性 | 第19页 |
| 1.4.3 提高酶的稳定性 | 第19页 |
| 1.4.4 有机溶剂的耐受性 | 第19-20页 |
| 1.5 论文的研究内容 | 第20-22页 |
| 第二章 HheC卤离子结合区氨基酸的丙氨酸扫描 | 第22-30页 |
| 2.1 实验材料和方法 | 第22-23页 |
| 2.1.1 实验材料 | 第22页 |
| 2.1.2 实验仪器及设备 | 第22-23页 |
| 2.1.3 试剂配制 | 第23页 |
| 2.2 实验方法 | 第23-25页 |
| 2.2.1 丙氨酸突变体的构建 | 第23-24页 |
| 2.2.2 丙氨酸突变体表达的优化 | 第24页 |
| 2.2.3 丙氨酸突变体的催化活性检测 | 第24-25页 |
| 2.2.4 丙氨酸突变体的动力学拆分 | 第25页 |
| 2.3 实验结果和讨论 | 第25-28页 |
| 2.3.1 丙氨酸突变体表达效果的优化 | 第25-26页 |
| 2.3.2 丙氨酸突变体活性检测 | 第26-27页 |
| 2.3.3 丙氨酸突变体对映体选择性的检测 | 第27-28页 |
| 2.4 本章总结 | 第28-30页 |
| 第三章 关键位点饱和突变体文库构建、筛选及分析 | 第30-42页 |
| 3.1 实验材料 | 第30页 |
| 3.2 实验方法 | 第30-31页 |
| 3.2.1 突变体文库的构建 | 第30页 |
| 3.2.2 饱和突变体文库的筛选 | 第30-31页 |
| 3.2.3 突变体的催化活性检测 | 第31页 |
| 3.2.4 突变体的动力学拆分 | 第31页 |
| 3.3 实验结果和讨论 | 第31-40页 |
| 3.3.1 关键位点文库构建及筛选 | 第31-32页 |
| 3.3.2 关键位点文库的活性检测结果及分析 | 第32-38页 |
| 3.3.2.1 P175位点的活性检测分析结果 | 第32-33页 |
| 3.3.2.2 N176位点的活性检测分析结果 | 第33页 |
| 3.3.2.3 Y177位点的活性检测分析结果 | 第33-34页 |
| 3.3.2.4 L178位点的活性检测分析结果 | 第34-35页 |
| 3.3.2.5 Y185位点的活性检测分析结果 | 第35页 |
| 3.3.2.6 F186位点的活性检测分析结果 | 第35-36页 |
| 3.3.2.7 Y187位点的活性检测分析结果 | 第36-37页 |
| 3.3.2.8 S180、S183、P188位点的活性检测分析结果 | 第37-38页 |
| 3.3.3 关键位点文库的动力学拆分 | 第38-40页 |
| 3.3.3.1 HheC以及突变体脱卤反应对映体选择性的测定 | 第38-39页 |
| 3.3.3.2 HheC以及突变体开环反应对映体选择性的测定 | 第39-40页 |
| 3.4 本章总结 | 第40-42页 |
| 第四章 优势突变体的性质分析 | 第42-52页 |
| 4.1 实验材料 | 第42页 |
| 4.2 实验方法 | 第42-44页 |
| 4.2.1 酶的纯化 | 第42-43页 |
| 4.2.2 PNSHH的活性检测 | 第43页 |
| 4.2.3 稳态动力学常数的测定 | 第43页 |
| 4.2.4 HheC的荧光测量—稳态配体的结合 | 第43-44页 |
| 4.2.5 亲和试剂与酶结合能力的检测 | 第44页 |
| 4.2.6 停流荧光检测 | 第44页 |
| 4.3 实验结果和讨论 | 第44-51页 |
| 4.3.1 PNSHH的活性检测 | 第44-45页 |
| 4.3.2 亲和力的测定 | 第45-46页 |
| 4.3.3 HheC以及突变体的荧光测定 | 第46-47页 |
| 4.3.4 突变体的动力学常数测定 | 第47-49页 |
| 4.3.5 卤离子结合前后的分子动力学模拟 | 第49页 |
| 4.3.6 优势突变体突变体F12Y和L178V停流荧光测定 | 第49-51页 |
| 4.4 本章总结 | 第51-52页 |
| 第五章 卤离子结合区域氨基酸的结构基础分析 | 第52-66页 |
| 5.1 实验材料 | 第52页 |
| 5.2 实验方法 | 第52-53页 |
| 5.2.1 凝胶过滤 | 第52页 |
| 5.2.2 凝胶过滤标准曲线的制备 | 第52-53页 |
| 5.3 实验结果和讨论 | 第53-65页 |
| 5.3.1 H179、E181、D182和P184热稳定性分析 | 第53-54页 |
| 5.3.2 S180、S183和P188结构稳定性分析 | 第54-58页 |
| 5.3.3 疏水相互作用的结构分析 | 第58-63页 |
| 5.3.3.1 Y177位点的结构分析 | 第59页 |
| 5.3.3.2 L178位点的结构分析 | 第59-61页 |
| 5.3.3.3 Y185位点的结构分析 | 第61-62页 |
| 5.3.3.4 F186位点的结构分析 | 第62页 |
| 5.3.3.5 Y187位点的结构分析 | 第62-63页 |
| 5.3.4 突变体对映体选择性偏好的结构分析 | 第63-65页 |
| 5.4 本章总结 | 第65-66页 |
| 第六章 总结与展望 | 第66-70页 |
| 6.1 全文总结 | 第66-67页 |
| 6.2 后续工作展望 | 第67-70页 |
| 6.2.1 卤醇脱卤酶疏水相互作用的探究 | 第67-69页 |
| 6.2.2 卤醇脱卤酶卤HheC卤离子释放通道的研究 | 第69-70页 |
| 致谢 | 第70-71页 |
| 参考文献 | 第71-76页 |
| 攻读硕士学位期间取得的成果 | 第76页 |
