| 摘要 | 第9-11页 |
| ABSTRACT | 第11-12页 |
| 常用缩略词表 | 第13-14页 |
| 第一章 文献综述 | 第14-31页 |
| 1 前言 | 第14页 |
| 2 肌肉的生长发育过程 | 第14-16页 |
| 3 与肌肉形成相关的信号通路 | 第16-18页 |
| 4 候选基因的选择 | 第18-21页 |
| 4.1 ROCK1，ROCK2基因 | 第18-20页 |
| 4.2 Sp1转录因子 | 第20-21页 |
| 5 基因转录调控的研究 | 第21-31页 |
| 5.1 启动子 | 第22-25页 |
| 5.1.1 启动子的结构和分类 | 第22-23页 |
| 5.1.2 启动子与肌肉发育调节 | 第23-24页 |
| 5.1.3 启动子的研究方法 | 第24-25页 |
| 5.2 miRNA | 第25-31页 |
| 5.2.1 miRNA的形成、发育、功能 | 第25-27页 |
| 5.2.2 miRNA与肌肉发育调节 | 第27-29页 |
| 5.2.3 miRNA的研究方法 | 第29-31页 |
| 第二章 研究的目的和意义 | 第31-32页 |
| 第三章 材料与方法 | 第32-57页 |
| 1 实验材料 | 第32-36页 |
| 1.1 试验样品 | 第32页 |
| 1.2 主要仪器与设备 | 第32页 |
| 1.3 主要试剂及试剂盒 | 第32-33页 |
| 1.4 常用化学试剂配制 | 第33-35页 |
| 1.5 载体、菌株及细胞系 | 第35-36页 |
| 1.6 主要分子生物学软件及数据库 | 第36页 |
| 2 试验方法 | 第36-57页 |
| 2.1 总RNA的提取及c DNA合成 | 第36-38页 |
| 2.1.1 总RNA的提取 | 第36-37页 |
| 2.1.2 c DNA合成及合成效果检测 | 第37-38页 |
| 2.2 实时荧光定量PCR | 第38-40页 |
| 2.3 猪ROCK1和ROCK2基因 5’上游调控区域的扩增 | 第40-42页 |
| 2.3.1 序列扩增 | 第40-41页 |
| 2.3.2 启动子 5’端不同缺失片段载体的构建 | 第41-42页 |
| 2.3.2.2 启动子 5’端不同缺失片段真核表达载体的构建 | 第42页 |
| 2.3.3 质粒提取 | 第42页 |
| 2.4 细胞培养和转染 | 第42-43页 |
| 2.4.1 细胞培养 | 第42-43页 |
| 2.4.2 瞬时转染 | 第43页 |
| 2.4.3 细胞冻存与复苏 | 第43页 |
| 2.5 启动子活性检测 | 第43-44页 |
| 2.6 蛋白质提取 | 第44-45页 |
| 2.6.1 核蛋白质提取 | 第44-45页 |
| 2.6.2 活性蛋白质提取 | 第45页 |
| 2.6.3 总蛋白质提取 | 第45页 |
| 2.7 猪ROCK1和ROCK2基因 5′ 端上游调控区域转录因子分析 | 第45-55页 |
| 2.7.1 转录因子的预测及分析 | 第45-46页 |
| 2.7.2 转录因子结合位点突变载体构建 | 第46-47页 |
| 2.7.3 凝胶迁移阻滞实验（EMSA） | 第47-50页 |
| 2.7.4 染色质免疫共沉淀实验（Ch IP） | 第50-53页 |
| 2.7.5 DNA pull down | 第53页 |
| 2.7.6 超表达转录因子 | 第53-54页 |
| 2.7.6.1 转录因子超表达载体的构建 | 第53-54页 |
| 2.7.6.2 质粒共转染 | 第54页 |
| 2.7.7 Sp1的特异抑制 | 第54-55页 |
| 2.7.8 Western blot | 第55页 |
| 2.8 猪ROCK1和ROCK2基因 3’端调控区域miRNA分析 | 第55-56页 |
| 2.8.1 miR335p、miR-376c-3p和miR1423p结合位点的验证 | 第56页 |
| 2.8.2 miR335p、miR-376c-3p对基因转录和翻译的影响 | 第56页 |
| 2.9 细胞周期检测 | 第56页 |
| 2.10 免疫荧光 | 第56-57页 |
| 第四章 结果与分析 | 第57-94页 |
| 1 猪ROCK1基因转录调控机制的研究 | 第57-79页 |
| 1.1 猪ROCK1组织表达谱分析 | 第57页 |
| 1.2 猪ROCK1基因启动子的克隆分离以及序列准确性鉴定 | 第57-59页 |
| 1.3 猪ROCK1基因核心启动子的确定 | 第59-60页 |
| 1.4 ROCK1-P5片段转录因子结合位点预测 | 第60-61页 |
| 1.5 Sp1转录因子结合位点的验证 | 第61-69页 |
| 1.5.1 Sp1转录因子结合位点的定点突变 | 第61-62页 |
| 1.5.2 Sp1转录因子与ROCK1核心启动子区域的体外结合 | 第62-67页 |
| 1.5.3 Sp1转录因子与ROCK1核心启动子区域的体内结合 | 第67-69页 |
| 1.6 Sp1转录因子超表达对ROCK1基因的影响 | 第69-72页 |
| 1.6.1 Sp1对ROCK1基因启动子活性的影响 | 第69-71页 |
| 1.6.2 过表达Sp1对ROCK1基因表达水平的影响 | 第71-72页 |
| 1.7 Sp1转录因子抑制对ROCK1基因的影响 | 第72-75页 |
| 1.8 Sp1转录因子促进肌肉分化过程 | 第75-77页 |
| 1.9 Sp1转录因子对细胞周期的影响 | 第77-79页 |
| 2 miRNA对ROCK1基因表达的调控 | 第79-81页 |
| 2.1 miR335p，miR-376c-3p与ROCK1基因 3’UTR区域的结合 | 第79-80页 |
| 2.2 miR335p，miR-376c-3p对ROCK1基因表达的调控 | 第80-81页 |
| 3 猪ROCK2基因表达的调控 | 第81-90页 |
| 3.1 猪ROCK2组织表达谱分析 | 第81-82页 |
| 3.2 猪ROCK2基因启动子的克隆分离以及序列准确性鉴定 | 第82-84页 |
| 3.3 猪ROCK2基因核心启动子的确定 | 第84-85页 |
| 3.4 ROCK2的 5’侧翼序列转录因子结合位点预测 | 第85页 |
| 3.5 C/EBPα 转录因子结合位点的验证 | 第85-88页 |
| 3.5.1 C/EBPα 转录因子结合位点的定点突变 | 第87页 |
| 3.5.2 C/EBPα 转录因子与ROCK2核心启动子区域的体外结合 | 第87-88页 |
| 3.6 ROCK2基因在C3H10T1/2 细胞中的表达 | 第88-89页 |
| 3.7 C/EBPα 转录因子对ROCK2基因表达的影响 | 第89-90页 |
| 4 miRNA对ROCK2基因表达的调控 | 第90-94页 |
| 4.1 miR1423p与ROCK2基因 3’UTR区域的结合 | 第90-91页 |
| 4.2 miR1423p对ROCK2基因表达的调控 | 第91-92页 |
| 4.3 miR1423p对肌肉分化的影响 | 第92-94页 |
| 第五章 讨论 | 第94-102页 |
| 1 ROCK1和ROCK2基因的组织表达分析 | 第94-95页 |
| 2 核心启动子的确定 | 第95-96页 |
| 3 Sp1转录因子与猪ROCK1基因启动子 | 第96-97页 |
| 4 Sp1转录因子与猪ROCK1基因 | 第97-98页 |
| 5 Sp1转录因子对细胞周期和肌肉分化的影响 | 第98页 |
| 6 C/EBPα 转录因子 | 第98-99页 |
| 7 C/EBPα 转录因子与猪ROCK2基因 | 第99-100页 |
| 8 C/EBPα 转录因子与脂肪形成 | 第100页 |
| 9 miRNA | 第100-101页 |
| 10 miRNA对ROCK1，ROCK2基因的影响 | 第101-102页 |
| 第六章 结论 | 第102-104页 |
| 1 主要结论 | 第102页 |
| 2 主要创新点 | 第102-103页 |
| 3 本研究不足之处及下一步计划 | 第103-104页 |
| 参考文献 | 第104-128页 |
| 附录 | 第128-130页 |
| 附录1 猪Sp1基因CDS序列 | 第128-129页 |
| 附录2 猪Myog基因CDS序列 | 第129页 |
| 附录3 小鼠C/EBPα 基因CDS序列 | 第129-130页 |
| 致谢 | 第130-131页 |
| 在读期间发表的文章 | 第131-132页 |
