| 摘要 | 第6-10页 |
| ABSTRACT | 第10-13页 |
| 缩略表 | 第14-20页 |
| 第一章 前言 | 第20-52页 |
| 1.1 氮杂环污染物概述 | 第20-21页 |
| 1.2 尼古丁及其环境污染 | 第21-26页 |
| 1.2.1 尼古丁的基本性质 | 第21-22页 |
| 1.2.2 尼古丁的毒害作用 | 第22-24页 |
| 1.2.3 环境中的尼古丁污染 | 第24-26页 |
| 1.3 微生物尼古丁代谢机制研究进展 | 第26-46页 |
| 1.3.1 尼古丁代谢微生物 | 第26-29页 |
| 1.3.2 微生物代谢尼古丁的途径及分子机制 | 第29-42页 |
| 1.3.2.1 脱甲基代谢途径 | 第29-31页 |
| 1.3.2.2 吡啶代谢途径及分子机制 | 第31-35页 |
| 1.3.2.3 吡咯烷代谢途径及分子机制 | 第35-39页 |
| 1.3.2.4 吡啶吡咯烷交叉代谢途径 | 第39-41页 |
| 1.3.2.5 五条吡咯烷途径变化途径 | 第41-42页 |
| 1.3.3 微生物尼古丁代谢相关酶的酶学研究进展 | 第42-46页 |
| 1.4 尼古丁代谢细菌的基因组学研究 | 第46-51页 |
| 1.4.1 Pseudomonas putida S16基因组 | 第46-48页 |
| 1.4.2 Pseudomonas geniculata N1基因组 | 第48页 |
| 1.4.3 Nocardioides sp. JS614及Rhodococcus opacus B4基因组 | 第48-50页 |
| 1.4.4 尼古丁代谢节杆菌的基因组学研究 | 第50-51页 |
| 1.5 本课题的研究意义 | 第51-52页 |
| 第二章 假单胞菌S16尼古丁下游代谢关键基因/簇分离鉴定 | 第52-82页 |
| 2.1 引言 | 第52-53页 |
| 2.2 材料与方法 | 第53-61页 |
| 2.2.1 仪器、试剂和缓冲液 | 第53页 |
| 2.2.2 菌株、质粒和引物 | 第53页 |
| 2.2.3 培养基及菌株培养条件 | 第53-55页 |
| 2.2.4 分子生物学操作 | 第55页 |
| 2.2.5 休止细胞制备 | 第55页 |
| 2.2.6 HPLC检测休止细胞的降解能力 | 第55-56页 |
| 2.2.7 简并引物设计 | 第56-58页 |
| 2.2.8 进化树构建 | 第58页 |
| 2.2.9 总RNA提取 | 第58-59页 |
| 2.2.10 反转录PCR (RT-PCR) | 第59-60页 |
| 2.2.11 P. putida S16电转感受态细胞制备 | 第60页 |
| 2.2.12 P. putida S16基因敲除菌株构建 | 第60-61页 |
| 2.3 结果与讨论 | 第61-80页 |
| 2.3.1 简并引物扩增尼古丁代谢下游基因（簇） | 第61-70页 |
| 2.3.1.1 P. putida S16休止细胞降解 2,5-DHP | 第61-62页 |
| 2.3.1.2 设计简并引物 | 第62-63页 |
| 2.3.1.3 摸索简并引物PCR扩增的退火温度 | 第63-65页 |
| 2.3.1.4 简并引物PCR扩增可能的目的基因 | 第65-66页 |
| 2.3.1.5 简并引物PCR产物的克隆及测序鉴定 | 第66-67页 |
| 2.3.1.6 构建hpo基因的重组表达质粒 | 第67-68页 |
| 2.3.1.7 hpo基因功能初步探索 | 第68-69页 |
| 2.3.1.8 定位尼古丁下游代谢基因簇nic2 | 第69-70页 |
| 2.3.2 nic2基因簇生物信息学分析 | 第70-73页 |
| 2.3.3 代谢物对nic基因簇各基因转录的影响 | 第73-75页 |
| 2.3.4 nic2基因簇在尼古丁代谢中的关键作用 | 第75-80页 |
| 2.3.4.1 检测P. putida S16能否降解烟酸 | 第75-76页 |
| 2.3.4.2 构建P. putida S16基因敲除突变株 | 第76-77页 |
| 2.3.4.3 各基因敲除菌株的尼古丁代谢能力 | 第77-80页 |
| 2.4 本章小结 | 第80-82页 |
| 第三章 2,5-二羟基吡啶双加氧酶（Hpo和NicX）的性质研究 | 第82-129页 |
| 3.1 引言 | 第82-84页 |
| 3.2 材料与方法 | 第84-96页 |
| 3.2.1 仪器、试剂和缓冲液 | 第84页 |
| 3.2.2 菌株、质粒和引物 | 第84页 |
| 3.2.3 培养基及菌株培养条件 | 第84页 |
| 3.2.4 分子生物学操作 | 第84-85页 |
| 3.2.5 外源蛋白的诱导表达 | 第85页 |
| 3.2.6 粗酶液制备 | 第85页 |
| 3.2.7 带His标签蛋白的亲和纯化 | 第85-86页 |
| 3.2.8 不带标签Hpo的纯化 | 第86-87页 |
| 3.2.9 蛋白浓度测定 | 第87页 |
| 3.2.10 Hpo定点突变 | 第87-88页 |
| 3.2.11 酶活性检测 | 第88-89页 |
| 3.2.12 酶动力学参数确定 | 第89-90页 |
| 3.2.13 凝胶层析确定活性蛋白大小 | 第90-91页 |
| 3.2.14 O_2消耗检测 | 第91页 |
| 3.2.15 ~(18)O标记实验 | 第91-92页 |
| 3.2.16 非血红素Fe~(2+)依赖型双加氧酶进化树分析 | 第92页 |
| 3.2.17 Hpo保守序列分析 | 第92-94页 |
| 3.2.18 Hpo及其突变体Fe~(2+)结合比例测定 | 第94页 |
| 3.2.19 Hpo底物特异性检测 | 第94页 |
| 3.2.20 蛋白结构预测 | 第94页 |
| 3.2.21 蛋白二级结构含量分析 | 第94-95页 |
| 3.2.22 检测技术 | 第95-96页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第96-127页 |
| 3.3.1 His-Hpo的诱导、表达和纯化 | 第96-99页 |
| 3.3.2 His-Hpo的酶学性质 | 第99-102页 |
| 3.3.2.1 His-Hpo的聚合状态 | 第99-100页 |
| 3.3.2.2 pH对His-Hpo酶活的影响 | 第100页 |
| 3.3.2.3 温度对His-Hpo酶活的影响 | 第100-101页 |
| 3.3.2.4 金属离子对His-Hpo酶活的影响 | 第101-102页 |
| 3.3.2.5 His-Hpo的酶动力学参数 | 第102页 |
| 3.3.3 无外源氨基酸的Hpo的表达纯化 | 第102-105页 |
| 3.3.4 Hpo与His-Hpo的性质比较 | 第105-109页 |
| 3.3.4.1 Hpo的聚合状态 | 第105-107页 |
| 3.3.4.2 pH、温度和金属离子对Hpo酶活的影响 | 第107页 |
| 3.3.4.3 Hpo的酶动力学参数 | 第107-108页 |
| 3.3.4.4 总结比较 | 第108-109页 |
| 3.3.5 Hpo的酶学性质 | 第109-115页 |
| 3.3.5.1 Hpo催化反应中的O_2消耗 | 第109页 |
| 3.3.5.2 Hpo催化反应产物中的O原子来源 | 第109-111页 |
| 3.3.5.3 Hpo的底物特异性 | 第111-113页 |
| 3.3.5.4 Hpo的氨基肽酶活性 | 第113-114页 |
| 3.3.5.5 Hpo的去甲酰酶活性 | 第114-115页 |
| 3.3.6 Hpo三维结构预测 | 第115-117页 |
| 3.3.7 Hpo定点突变 | 第117-123页 |
| 3.3.7.1 Hpo点突变体的表达纯化 | 第117-118页 |
| 3.3.7.2 Hpo点突变体的 2,5-DHP双加氧酶活性 | 第118-119页 |
| 3.3.7.3 Hpo及其点突变体的Fe~(2+)结合能力 | 第119-121页 |
| 3.3.7.4 Hpo及其点突变体的二级结构 | 第121-123页 |
| 3.3.8 Hpo与NicX结构与性质比较 | 第123-127页 |
| 3.3.8.1 Hpo与NicX的结构比较 | 第124-125页 |
| 3.3.8.2 Hpo与NicX的催化活性比较 | 第125-126页 |
| 3.3.8.3 Hpo与NicX的酶动力学参数比较 | 第126-127页 |
| 3.4 本章小结 | 第127-129页 |
| 第四章 NFM去甲酰酶和马来酰胺酸酰胺酶的性质研究 | 第129-148页 |
| 4.1 引言 | 第129-130页 |
| 4.2 材料与方法 | 第130-134页 |
| 4.2.1 仪器、试剂和缓冲液 | 第130页 |
| 4.2.2 菌株、质粒和引物 | 第130页 |
| 4.2.3 培养基及菌株培养条件 | 第130页 |
| 4.2.4 分子生物学操作 | 第130-131页 |
| 4.2.5 蛋白的诱导表达、纯化及浓度测定 | 第131页 |
| 4.2.6 酶活性检测 | 第131-132页 |
| 4.2.7 序列比对 | 第132-133页 |
| 4.2.8 蛋白结构预测 | 第133页 |
| 4.2.9 检测技术 | 第133-134页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第134-147页 |
| 4.3.1 nfo和ami基因的表达菌株构建 | 第134-135页 |
| 4.3.2 His-Nfo蛋白的纯化 | 第135-138页 |
| 4.3.3 His-Nfo的酶学性质 | 第138-141页 |
| 4.3.3.1 His-Nfo催化NFM去甲酰化生成HCOOH | 第138-139页 |
| 4.3.3.2 His-Nfo催化NFM去甲酰化生成马来酰胺酸 | 第139页 |
| 4.3.3.3 His-Nfo催化NFF的去甲酰化 | 第139-140页 |
| 4.3.3.4 His-Nfo催化NFM和NFF水解的动力学参数 | 第140-141页 |
| 4.3.4 Nfo的结构预测 | 第141-144页 |
| 4.3.5 His-Ami蛋白的纯化 | 第144-146页 |
| 4.3.6 His-Ami蛋白的酶活检测 | 第146-147页 |
| 4.4 本章小结 | 第147-148页 |
| 第五章 尼古丁代谢节杆菌M2012083比较基因组分析 | 第148-172页 |
| 5.1 引言 | 第148页 |
| 5.2 材料与方法 | 第148-151页 |
| 5.2.1 菌株M2012083的来源与保藏 | 第148页 |
| 5.2.2 菌株M2012083的培养 | 第148-149页 |
| 5.2.3 菌株M2012083基因组提取 | 第149页 |
| 5.2.4 16S rDNA进化树构建 | 第149页 |
| 5.2.5 菌株鉴定 | 第149页 |
| 5.2.6 基因组测序及组装 | 第149-150页 |
| 5.2.7 基因组注释 | 第150页 |
| 5.2.8 比较基因组分析 | 第150-151页 |
| 5.3 结果与讨论 | 第151-170页 |
| 5.3.1 菌株M2012083的鉴定 | 第151-158页 |
| 5.3.2 节杆菌M2012083的基因组信息 | 第158页 |
| 5.3.3 七株节杆菌的基因组比较 | 第158-163页 |
| 5.3.4 节杆菌M2012083中尼古丁代谢相关基因 | 第163-165页 |
| 5.3.5 节杆菌M2012083中压力应答相关基因 | 第165-170页 |
| 5.3.5.1 渗透压力应答 | 第167-168页 |
| 5.3.5.2 氧化压力应答 | 第168-169页 |
| 5.3.5.3 冷或热激应答 | 第169页 |
| 5.3.5.4 脱毒作用 | 第169-170页 |
| 5.3.5.5 其他压力应答蛋白 | 第170页 |
| 5.4 本章小结 | 第170-172页 |
| 结论与展望 | 第172-177页 |
| 创新点 | 第177-178页 |
| 参考文献 | 第178-196页 |
| 附录I 仪器设备 | 第196-198页 |
| 附录II 主要试剂 | 第198-200页 |
| 附录III 缓冲液 | 第200-202页 |
| 附录IV 菌株及质粒 | 第202-204页 |
| 附录V 引物信息 | 第204-206页 |
| 附录VI 标准曲线 | 第206-209页 |
| 附录VII 七株节杆菌中的压力应答蛋白 | 第209-219页 |
| 致谢 | 第219-221页 |
| 攻读博士期间（待）发表论文及所获奖励 | 第221-222页 |
