| 摘要 | 第4-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 1文献综述 | 第10-15页 |
| 1.1 铁皮石斛简介 | 第10页 |
| 1.2 萜类化合物生物合成途径研究进展 | 第10-13页 |
| 1.2.1 MVA和MEP途径 | 第10-13页 |
| 1.2.2 MVA和MEP途径抑制剂的应用 | 第13页 |
| 1.3 DXS、DXR、HDR研究进展 | 第13-15页 |
| 2 引言 | 第15-18页 |
| 2.1 研究目的和意义 | 第15-16页 |
| 2.2 主要研究内容 | 第16-17页 |
| 2.3 技术路线 | 第17-18页 |
| 3 材料与方法 | 第18-27页 |
| 3.1 试验材料 | 第18页 |
| 3.1.1 铁皮石斛试管苗和原球茎的培养 | 第18页 |
| 3.1.2 菌株和质粒 | 第18页 |
| 3.2 仪器和试剂 | 第18-19页 |
| 3.2.1 主要仪器 | 第18页 |
| 3.2.2 主要试剂 | 第18-19页 |
| 3.3 试验方法 | 第19-27页 |
| 3.3.1 总RNA的提取与cDNA合成 | 第19页 |
| 3.3.2 引物设计 | 第19-21页 |
| 3.3.3 保守区片段的扩增 | 第21页 |
| 3.3.4 RACE扩增及全长c DNA序列的获得 | 第21-22页 |
| 3.3.5 生物信息学分析 | 第22页 |
| 3.3.6 DoDXS、DoDXR、DoHDR的组织特异性表达分析 | 第22页 |
| 3.3.7 DoDXS、DoDXR、DoHDR在激素诱导下的表达模式分析 | 第22页 |
| 3.3.8 DoDXS、DoDXR、DoHDR真核表达载体的构建 | 第22-23页 |
| 3.3.9 DoDXS、DoDXR、DoHDR亚细胞定位分析 | 第23-24页 |
| 3.3.10 DoDXS、DoDXR遗传转化过表达 | 第24页 |
| 3.3.11 抑制剂对铁皮石斛适宜抑制浓度的选择 | 第24页 |
| 3.3.12 铁皮石斛总生物碱含量的测定 | 第24-25页 |
| 3.3.13 HMGR和DXR酶活性的测定 | 第25-26页 |
| 3.3.14 抑制剂对MVA和MEP途径关键基因表达量的影响 | 第26-27页 |
| 4 结果与分析 | 第27-60页 |
| 4.1 DoDXS的克隆与生物信息学分析 | 第27-32页 |
| 4.1.1 总RNA的提取与检测 | 第27页 |
| 4.1.2 DoDXS核心片段的扩增 | 第27页 |
| 4.1.3 DoDXS 3’RACE和5’RACE扩增 | 第27-28页 |
| 4.1.4 DoDXS的全长cDNA验证 | 第28页 |
| 4.1.5 DoDXS编码的氨基酸序列分析 | 第28-29页 |
| 4.1.6 DoDXS编码的氨基酸的同源性比对 | 第29-30页 |
| 4.1.7 DoDXS蛋白的细胞定位预测分析 | 第30-31页 |
| 4.1.8 DoDXS蛋白的二级结构分析 | 第31页 |
| 4.1.9 DoDXS蛋白的三级结构分析 | 第31-32页 |
| 4.2 DoDXR的克隆与生物信息学分析 | 第32-37页 |
| 4.2.1 DoDXR核心片段的扩增 | 第32页 |
| 4.2.2 DoDXR 3’RACE和5’RACE扩增 | 第32页 |
| 4.2.3 DoDXR的全长cDNA验证 | 第32-33页 |
| 4.2.4 DoDXR编码的氨基酸序列分析 | 第33-34页 |
| 4.2.5 DoDXR编码的氨基酸的同源性比对 | 第34-35页 |
| 4.2.6 DoDXR蛋白的细胞定位预测分析 | 第35-36页 |
| 4.2.7 DoDXR蛋白的二级结构分析 | 第36页 |
| 4.2.8 DoDXR蛋白的三级结构分析 | 第36-37页 |
| 4.3 DoHDR的克隆与生物信息学分析 | 第37-42页 |
| 4.3.1 DoHDR核心片段的扩增 | 第37页 |
| 4.3.2 DoHDR 3’RACE和5’RACE扩增 | 第37页 |
| 4.3.3 DoHDR的全长cDNA验证 | 第37-38页 |
| 4.3.4 DoHDR编码的氨基酸序列分析 | 第38-39页 |
| 4.3.5 DoHDR编码的氨基酸的同源性比对 | 第39-40页 |
| 4.3.6 DoHDR蛋白的细胞定位预测分析 | 第40-41页 |
| 4.3.7 DoHDR蛋白的二级结构分析 | 第41页 |
| 4.3.8 DoHDR蛋白的三级结构分析 | 第41-42页 |
| 4.4 DoDXS、DoDXR、DoHDR的表达特征分析 | 第42-47页 |
| 4.4.1 实时荧光定量PCR标准曲线的确定 | 第42-43页 |
| 4.4.2 DoDXS、DoDXR、DoHDR的组织特异性表达分析 | 第43-44页 |
| 4.4.3 MeJA处理对DoDXS、DoDXR、DoHDR表达的影响 | 第44-45页 |
| 4.4.4 SA处理对DoDXS、DoDXR、DoHDR表达的影响 | 第45页 |
| 4.4.5 ABA处理对DoDXS、DoDXR、DoHDR表达的影响 | 第45-46页 |
| 4.4.6 BR处理对DoDXS、DoDXR、DoHDR表达的影响 | 第46-47页 |
| 4.5 DoDXS、DoDXR、DoHDR真核表达分析 | 第47-57页 |
| 4.5.1 真核表达载体的构建 | 第47-50页 |
| 4.5.2 DoDXS、DoDXR、DoHDR的亚细胞定位 | 第50-52页 |
| 4.5.3 DoDXS转基因拟南芥的获得与分子鉴定 | 第52-55页 |
| 4.5.4 转基因拟南芥DoDXS过表达量 | 第55页 |
| 4.5.5 DoDXR 转基因拟南芥的获得 | 第55-57页 |
| 4.6 MVA和MEP途径抑制剂对铁皮石斛总生物碱积累的影响 | 第57-60页 |
| 4.6.1 抑制剂适宜浓度的确定 | 第57-58页 |
| 4.6.2 抑制剂对铁皮石斛总生物碱积累的影响 | 第58页 |
| 4.6.3 抑制剂处理对MVA和MEP途径关键酶活性的影响 | 第58-59页 |
| 4.6.4 抑制剂处理对MVA和MEP途径相关基因表达量的影响 | 第59-60页 |
| 5 讨论 | 第60-63页 |
| 5.1 DoDXS、DoDXR、DoHDR的表达模式分析 | 第60-61页 |
| 5.2 抑制剂对铁皮石斛生物碱合成的影响 | 第61页 |
| 5.3 MEP途径在铁皮石斛生物碱合成中的作用 | 第61-63页 |
| 6 结论 | 第63-64页 |
| 参考文献 | 第64-69页 |
| 附录 | 第69-70页 |
| 致谢 | 第70-71页 |
| 作者简历 | 第71页 |
| 成果清单 | 第71页 |
