| 摘要 | 第1-6页 |
| Abstract | 第6-10页 |
| 第1章 文献综述 | 第10-23页 |
| ·EPO及长效EPO(NESP)的结构与功能 | 第10-12页 |
| ·EPO的结构 | 第10页 |
| ·EPO的生理功能 | 第10-11页 |
| ·长效EPO(NESP)的结构及功能 | 第11-12页 |
| ·蛋白质的糖基化 | 第12-15页 |
| ·糖基化的结构与特点 | 第12-14页 |
| ·糖基化的生物学作用 | 第14-15页 |
| ·动物细胞高效表达系统 | 第15-21页 |
| ·哺乳动物细胞宿主的选择 | 第15-16页 |
| ·影响外源蛋白表达的因素 | 第16-21页 |
| ·顺式作用元件 | 第16-17页 |
| ·目的基因扩增系统 | 第17-19页 |
| ·定点整合系统 | 第19-21页 |
| ·课题背景、目的及研究内容 | 第21-23页 |
| 第2章 适合外源基因定点整合细胞株的筛选及鉴定 | 第23-30页 |
| ·引言 | 第23页 |
| ·材料与方法 | 第23-26页 |
| ·实验材料 | 第23-24页 |
| ·方法 | 第24-26页 |
| ·微生物培养与保藏 | 第24页 |
| ·大肠杆菌TOP10的感受态细胞制备及转化 | 第24-25页 |
| ·质粒DNA小量抽提 | 第25页 |
| ·细胞培养 | 第25页 |
| ·CHO-K1细胞对Zeocin的药敏试验 | 第25-26页 |
| ·CHO-K1细胞转染实验 | 第26页 |
| ·转染后细胞株的筛选 | 第26页 |
| ·β-半乳糖苷酶酶活检测 | 第26页 |
| ·结果与讨论 | 第26-29页 |
| ·质粒小抽结果 | 第26-27页 |
| ·CHO-K1细胞对Zeocin的药敏浓度 | 第27页 |
| ·转染细胞筛选 | 第27页 |
| ·β-半乳糖苷酶酶活检测 | 第27-28页 |
| ·亚克隆细胞株的筛选 | 第28-29页 |
| ·小结 | 第29-30页 |
| 第3章 重族长效EPO(NESP)表达细胞株的构建 | 第30-46页 |
| ·引言 | 第30页 |
| ·材料与方法 | 第30-37页 |
| ·试剂与设备 | 第30-32页 |
| ·方法 | 第32-37页 |
| ·PCR反应 | 第32-33页 |
| ·双酶切反应体系 | 第33页 |
| ·琼脂糖凝胶电泳 | 第33页 |
| ·DNA连接反应体系 | 第33页 |
| ·质粒DNA小量抽提 | 第33页 |
| ·琼脂糖凝胶DNA回收 | 第33-34页 |
| ·CHO-K1细胞培养,转染及转染后单克隆细胞株的筛选 | 第34页 |
| ·NESP蛋白含量的ELISA检测方法 | 第34-35页 |
| ·mRNA抽提及逆转录 | 第35-36页 |
| ·荧光定量PCR检测NESP mRNA表达水平的差异 | 第36-37页 |
| ·CHO/FRT2/NESP2细胞株代谢参数和表达曲线测定 | 第37页 |
| ·结果与讨论 | 第37-44页 |
| ·pcDNA5/FRT/NESP载体的构建 | 第37-39页 |
| ·细胞筛选 | 第39页 |
| ·NESP蛋白的ELISA检测 | 第39-41页 |
| ·NESP序列验证 | 第41页 |
| ·利用荧光定量PCR检测各NESP的mRNA转录水平 | 第41-43页 |
| ·CHO/FRT2/NESP2细胞株的代谢特性和表达特性 | 第43-44页 |
| ·本章小结 | 第44-46页 |
| 第四章 长效EPO(NESP)的纯化与验证 | 第46-55页 |
| ·引言 | 第46页 |
| ·材料与方法 | 第46-50页 |
| ·试剂与设备 | 第46-47页 |
| ·方法 | 第47-50页 |
| ·细胞上清液的纯化 | 第47-48页 |
| ·NESP蛋白的SDS-PAGE蛋白电泳及Western blot分析 | 第48-49页 |
| ·固相pH梯度等电聚焦电泳 | 第49-50页 |
| ·结果与讨论 | 第50-53页 |
| ·NESP蛋白的纯化 | 第50-51页 |
| ·纯化后的NESP蛋白SDS-PAGE电泳及Western blot分析 | 第51-53页 |
| ·固相pH梯度等电聚焦电泳 | 第53页 |
| ·小结 | 第53-55页 |
| 第5章 结论与展望 | 第55-56页 |
| ·主要结论 | 第55页 |
| ·展望 | 第55-56页 |
| 参考文献 | 第56-62页 |
| 致谢 | 第62页 |
