| 摘要 | 第9-11页 |
| Abstract | 第11-12页 |
| Part Ⅰ CRISPR/Cas9技术构建KDM2A基因敲除细胞系 | 第13-40页 |
| 第一章 前言 | 第13-18页 |
| 1.1 KDM2A基因 | 第13-14页 |
| 1.1.1 KDM2A基因简介 | 第13页 |
| 1.1.2 KDM2A与增殖的关系 | 第13-14页 |
| 1.2 CRISPR/Cas9技术原理与应用 | 第14-17页 |
| 1.2.1 CRISPR/Cas9技术工作原理 | 第14-15页 |
| 1.2.2 CRISPR/Cas9医学领域应用 | 第15-16页 |
| 1.2.2.1 癌症模型 | 第15页 |
| 1.2.2.2 神经疾病模型 | 第15-16页 |
| 1.2.2.3 心血管模型 | 第16页 |
| 1.2.2.4 传染性疾病模型 | 第16页 |
| 1.2.2.5 免疫缺陷模型 | 第16页 |
| 1.2.3 CRISPR/Cas9 在医学疾病中的前景 | 第16-17页 |
| 1.3 本文构想 | 第17-18页 |
| 1.3.1 选题缘由 | 第17页 |
| 1.3.2 研究内容 | 第17-18页 |
| 第二章 实验材料、仪器和试剂 | 第18-22页 |
| 2.1 实验材料 | 第18页 |
| 2.2 实验仪器和耗材 | 第18-19页 |
| 2.2.1 实验仪器 | 第18-19页 |
| 2.3 实验所需试剂及耗材 | 第19-20页 |
| 2.3.1 试剂药品 | 第19-20页 |
| 2.3.2 实验耗材 | 第20页 |
| 2.4 溶液配制 | 第20-22页 |
| 第三章 实验方法 | 第22-30页 |
| 3.1 KDM2A基因靶位点设计与载体构建 | 第22-25页 |
| 3.1.1 sg RNA设计 | 第22-23页 |
| 3.1.2 KDM2A-p X458 载体构建 | 第23-25页 |
| 3.2 敲除细胞筛选与鉴定 | 第25-28页 |
| 3.2.1 p X458-KDM2A质粒提取 | 第25-26页 |
| 3.2.2 细胞转染 | 第26页 |
| 3.2.3 流式细胞仪分选 | 第26页 |
| 3.2.4 细胞基因组的提取 | 第26-27页 |
| 3.2.5 PCR扩增目的片段 | 第27页 |
| 3.2.6 Western Blotting检测KDM2A表达 | 第27-28页 |
| 3.2.6.1 蛋白质的提取 | 第28页 |
| 3.2.6.2 蛋白质浓度的测定 | 第28页 |
| 3.2.6.3 Western Blotting | 第28页 |
| 3.3 细胞生长速率测定 | 第28-29页 |
| 3.3.1 细胞计数 | 第28-29页 |
| 3.3.2 CCK8分析细胞生长速率 | 第29页 |
| 3.4 流式检测细胞增殖与凋亡 | 第29-30页 |
| 3.4.1 细胞增殖检测 | 第29页 |
| 3.4.2 细胞凋亡检测 | 第29-30页 |
| 第四章 实验结果 | 第30-37页 |
| 4.1 敲除载体构建 | 第30-31页 |
| 4.2 单克隆细胞筛选与鉴定 | 第31-34页 |
| 4.2.1 细胞转染 | 第31页 |
| 4.2.2 目的片段扩增 | 第31-32页 |
| 4.2.3 测序验证 | 第32页 |
| 4.2.4 KDM2A m RNA及蛋白质水平分析 | 第32-34页 |
| 4.3 敲除细胞系增殖与凋亡 | 第34-35页 |
| 4.3.1 细胞增殖检测 | 第34页 |
| 4.3.2 流式分析敲除细胞系增殖与凋亡 | 第34-35页 |
| 4.4 细胞增殖相关因子检测 | 第35-37页 |
| 第五章 讨论 | 第37-39页 |
| 5.1 关于KDM2A基因转录本的分析 | 第37页 |
| 5.2 打靶载体的选择 | 第37页 |
| 5.3 转染方式的比较 | 第37页 |
| 5.4 关于敲除细胞的鉴定 | 第37-38页 |
| 5.5 关于脱靶效应在细胞株以及小鼠中的比较 | 第38-39页 |
| 第六章 小结 | 第39-40页 |
| Part Ⅱ CRISPR/Cas9构建S100A9基因敲除小鼠 | 第40-64页 |
| 第一章 前言 | 第40-43页 |
| 1.1 哮喘 | 第40-41页 |
| 1.1.1 哮喘的简介 | 第40页 |
| 1.1.2 哮喘的症状与发病原因 | 第40-41页 |
| 1.1.3 哮喘模型 | 第41页 |
| 1.2 S100A9基因 | 第41页 |
| 1.3 本文构想 | 第41-43页 |
| 1.3.1 选题缘由 | 第41-42页 |
| 1.3.2 研究内容和结果 | 第42页 |
| 1.3.3 后续实验 | 第42-43页 |
| 第二章 实验材料和方法 | 第43-45页 |
| 2.1 实验动物及材料 | 第43-45页 |
| 2.1.1 实验动物 | 第43页 |
| 2.1.2 实验试剂 | 第43-45页 |
| 第三章 实验方法 | 第45-55页 |
| 3.1 靶位点设计 | 第45-47页 |
| 3.2 sg RNA合成 | 第47-48页 |
| 3.3 显微注射 | 第48-50页 |
| 3.3.1 受精卵获取 | 第48-49页 |
| 3.3.2 固定针和注射针的制作 | 第49页 |
| 3.3.3 显微注射 | 第49-50页 |
| 3.4 囊胚鉴定 | 第50-51页 |
| 3.4.1 囊胚DNA提取 | 第50页 |
| 3.4.2 PCR扩增目的片段 | 第50-51页 |
| 3.5 胚胎移植 | 第51-52页 |
| 3.5.1 制备结扎雄鼠 | 第51-52页 |
| 3.5.2 胚胎移植 | 第52页 |
| 3.6 F0代小鼠基因型鉴定 | 第52-55页 |
| 3.6.1 鼠尾DNA提取 | 第52-53页 |
| 3.6.2 PCR扩增目的片段 | 第53-55页 |
| 第四章 实验结果 | 第55-61页 |
| 4.1 sg RNA合成 | 第55页 |
| 4.2 胚胎显微注射 | 第55-57页 |
| 4.3 囊胚鉴定 | 第57-58页 |
| 4.4 胚胎移植 | 第58-59页 |
| 4.5 F0代小鼠基因型鉴定 | 第59-61页 |
| 第五章 讨论与展望 | 第61-64页 |
| 5.1 sg RNA设计策略 | 第61页 |
| 5.2 显微注射质量控制 | 第61-62页 |
| 5.3 靶位点活性分析 | 第62页 |
| 5.4 代孕小鼠品系的讨论 | 第62-63页 |
| 5.5 关于胚胎移植方法的讨论 | 第63页 |
| 5.6 展望 | 第63-64页 |
| 致谢 | 第64-66页 |
| 参考文献 | 第66-70页 |
| 附录A 攻读学位期间所发表的学术论文目录 | 第70页 |
