| 摘要 | 第3-6页 |
| Abstract | 第6-9页 |
| 英文缩写词表 | 第12-13页 |
| 第1章 引言 | 第13-21页 |
| 1.1 单基因遗传性疾病研究现状与基因治疗 | 第13-14页 |
| 1.2 基因组靶向修饰技术简介 | 第14-16页 |
| 1.3 CRISPR/Cas基因组靶向修饰技术 | 第16-17页 |
| 1.4 课题研究的意义 | 第17-18页 |
| 1.5 课题的技术路线 | 第18-21页 |
| 第2章 靶向Alb基因sgRNA的设计及筛选 | 第21-43页 |
| 2.1 实验材料 | 第22-24页 |
| 2.1.1 细胞、菌株及质粒载体 | 第22页 |
| 2.1.2 材料及试剂 | 第22页 |
| 2.1.3 试剂的配制 | 第22-24页 |
| 2.1.4 主要仪器设备 | 第24页 |
| 2.2 实验方法 | 第24-38页 |
| 2.2.1 针对Alb基因的sgRNA的设计 | 第24-25页 |
| 2.2.2 针对mAlb基因的sgRNA 1-4表达载体的构建 | 第25-28页 |
| 2.2.3 携带hCas9真核表达载体的构建 | 第28-35页 |
| 2.2.4 靶向mAlb基因的sgRNA 1-4的活性检测 | 第35-38页 |
| 2.3 实验结果 | 第38-41页 |
| 2.3.1 靶向mAlb基因sgRNA表达载体的构建 | 第38-39页 |
| 2.3.2 携带hCas9真核表达载体的构建 | 第39-40页 |
| 2.3.3 靶向mAlb基因sgRNA切割活性的检测 | 第40-41页 |
| 2.4 讨论 | 第41-43页 |
| 第3章 携带荧光素酶报告基因打靶载体的构建及测试 | 第43-59页 |
| 3.1 实验材料 | 第44页 |
| 3.1.1 细胞和菌种 | 第44页 |
| 3.1.2 载体和试剂 | 第44页 |
| 3.1.3 试剂的配制 | 第44页 |
| 3.1.4 主要仪器设备 | 第44页 |
| 3.2 实验方法 | 第44-53页 |
| 3.2.1 用于构建Alb基因定点整合载体同源臂的克隆 | 第45-48页 |
| 3.2.2 酶切获得带有T2A的荧光素酶报告基因 | 第48-49页 |
| 3.2.3 携带荧光素酶报告基因打靶载体的构建 | 第49-52页 |
| 3.2.4 荧光素酶报告基因表达的检测 | 第52-53页 |
| 3.2.5 荧光素酶报告基因定点整合的测序检测 | 第53页 |
| 3.3 实验结果 | 第53-56页 |
| 3.3.1 携带荧光素酶报告基因打靶载体的构建 | 第53-54页 |
| 3.3.2 使用荧光素酶检测系统检测打靶载体的重组效率 | 第54-56页 |
| 3.3.3 荧光素酶报告基因定点整合的测序检测 | 第56页 |
| 3.4 讨论 | 第56-59页 |
| 第4章 携带人GUSB治疗基因打靶载体的构建及测试 | 第59-75页 |
| 4.1 实验材料 | 第59-60页 |
| 4.1.1 细胞和菌种 | 第59页 |
| 4.1.2 载体和试剂 | 第59-60页 |
| 4.1.3 试剂的配制 | 第60页 |
| 4.1.4 主要仪器设备 | 第60页 |
| 4.2 实验方法 | 第60-68页 |
| 4.2.1 酶切获得GUSB治疗基因 | 第60-61页 |
| 4.2.2 携带GUSB治疗基因打靶载体的构建 | 第61-65页 |
| 4.2.3 Real-Time PCR技术检测mRNA水平的变化 | 第65-67页 |
| 4.2.4 Western-Blot技术检测蛋白表达水平的变化 | 第67-68页 |
| 4.2.5 使用GUS染色技术检测GUSB基因的蛋白表达 | 第68页 |
| 4.3 实验结果 | 第68-72页 |
| 4.3.0 携带GUSB治疗基因打靶载体的构建 | 第68页 |
| 4.3.1 观察mCherry红色荧光蛋白在Hepal-6细胞中的表达 | 第68-69页 |
| 4.3.2 Real-Time PCR检测靶基因mRNA水平 | 第69-71页 |
| 4.3.3 Western-Blot检测对蛋白表达水平 | 第71页 |
| 4.3.4 GUS染色技术检测GUSB基因表达 | 第71-72页 |
| 4.4 讨论 | 第72-75页 |
| 第5章 结论 | 第75-77页 |
| 参考文献 | 第77-85页 |
| 附录 | 第85-95页 |
| 致谢 | 第95-97页 |
| 攻读硕士学位期间科研成果 | 第97页 |
