| 摘要 | 第5-8页 |
| ABSTRACT | 第8-10页 |
| 第1章 绪论 | 第15-31页 |
| 1.1 丝状真菌 | 第15-20页 |
| 1.1.1 丝状真菌概述 | 第15页 |
| 1.1.2 丝状真菌的次级代谢产物概述 | 第15-20页 |
| 1.2 顶头孢霉与头孢菌素C | 第20-26页 |
| 1.2.1 顶头孢霉和头孢菌素C的发现 | 第20-21页 |
| 1.2.2 头孢菌素C的生物合成途径 | 第21-22页 |
| 1.2.3 头孢菌素C生物合成的调控 | 第22-23页 |
| 1.2.4 丝状真菌次级代谢与发育分化的关系 | 第23-26页 |
| 1.3 丝状真菌自噬的研究 | 第26-31页 |
| 1.3.1 自噬概述 | 第26-27页 |
| 1.3.2 自噬的发生过程 | 第27-28页 |
| 1.3.3 丝状真菌自噬研究的方法 | 第28-29页 |
| 1.3.4 丝状真菌自噬研究现状及展望 | 第29-31页 |
| 第2章 材料与方法 | 第31-55页 |
| 2.1 材料 | 第31-49页 |
| 2.1.1 菌株、质粒及引物 | 第31-40页 |
| 2.1.2 培养基 | 第40-42页 |
| 2.1.3 缓冲液及试剂 | 第42-49页 |
| 2.2 方法 | 第49-55页 |
| 2.2.1 大肠杆菌感受态细胞的制备与转化 | 第49-50页 |
| 2.2.2 农杆菌感受态细胞的制备与转化 | 第50-51页 |
| 2.2.3 农杆菌介导的真菌遗传转化(ATMT) | 第51页 |
| 2.2.4 抗生素检测方法 | 第51-52页 |
| 2.2.5 大肠杆菌质粒的快速提取 | 第52页 |
| 2.2.6 真菌基因组DNA的快速提取 | 第52页 |
| 2.2.7 RNA的提取 | 第52-53页 |
| 2.2.8 RNA浓度和纯度的检测 | 第53页 |
| 2.2.9 DNase Ⅰ处理RNA样品 | 第53页 |
| 2.2.10 实时定量PCR(Real-time PCR) | 第53页 |
| 2.2.11 分析工具 | 第53-55页 |
| 第3章 顶头孢霉AcmybA基因的功能研究 | 第55-77页 |
| 3.1 前言 | 第55-56页 |
| 3.2 材料 | 第56页 |
| 3.3 方法 | 第56-60页 |
| 3.3.1 顶头孢霉AC554突变株的获取 | 第56页 |
| 3.3.2 突变基因的克隆与鉴定 | 第56页 |
| 3.3.3 AcmybA基因敲除株的构建 | 第56-57页 |
| 3.3.4 构建△AcmybA的遗传互补株及AcmybA高表达菌株 | 第57页 |
| 3.3.5 AcMybA蛋白定位,碘化丙啶(PI)染色及显微观察 | 第57-58页 |
| 3.3.6 野生型、AcmyA突变株、互补株和AcmyA高表达株的产孢能力比较 | 第58页 |
| 3.3.7 液体发酵和头孢菌素的测定 | 第58页 |
| 3.3.8 AcMybA蛋白的表达 | 第58-59页 |
| 3.3.9 凝胶阻滞实验 | 第59-60页 |
| 3.4 结果 | 第60-75页 |
| 3.4.1 AC554突变株的获取与鉴定 | 第60-61页 |
| 3.4.2 AC554突变株的表型分析 | 第61-62页 |
| 3.4.3 AcmybA基因的克隆及序列分析 | 第62-63页 |
| 3.4.4 AcMybA蛋白定位的研究 | 第63-64页 |
| 3.4.5 AcmybA敲除株,互补株及AcmybA高表达株的构建 | 第64-65页 |
| 3.4.6 AcmybA通过调控AcbrlA控制顶头孢霉分生孢子的形成 | 第65-68页 |
| 3.4.7 AcmybA参与形成节孢子(“酵母状”细胞)的形成 | 第68-70页 |
| 3.4.8 高表达AcmybA抑制头孢菌素c的合成 | 第70-74页 |
| 3.4.9 高表达AcmybA能够促进顶头孢霉的生长和存活 | 第74-75页 |
| 3.5 讨论 | 第75-77页 |
| 第4章 顶头孢霉AcstuA基因的功能研究 | 第77-95页 |
| 4.1 前言 | 第77-78页 |
| 4.2 材料 | 第78页 |
| 4.3 方法 | 第78-81页 |
| 4.3.1 顶头孢霉AcstuA基因及其cDNA的克隆 | 第78页 |
| 4.3.2 AcstuA基因敲除株的构建 | 第78页 |
| 4.3.3 构建△AcstuA遗传互补株和AcstuA高表达株 | 第78-79页 |
| 4.3.4 野生型、AcstuA突变株、互补株和AcstuA高表达株的产孢能力比较 | 第79页 |
| 4.3.5 液体发酵和头孢菌素的测定 | 第79页 |
| 4.3.6 AcStuA DNA结合结构域蛋白的表达 | 第79-80页 |
| 4.3.7 凝胶阻滞实验 | 第80-81页 |
| 4.3.8 AcStuA蛋白定位及显微观察 | 第81页 |
| 4.4 结果 | 第81-92页 |
| 4.4.1 AcstuA基因的克隆及序列分析 | 第81-82页 |
| 4.4.2 AcStuA蛋白的定位 | 第82-83页 |
| 4.4.3 AcstuA敲除株,互补株以及AcstuA高表达株的构建 | 第83-85页 |
| 4.4.5 AcstuA控制顶头孢霉分生孢子的形成 | 第85-87页 |
| 4.4.6 AcstuA缺失导致头孢菌素产量下降 | 第87-88页 |
| 4.4.7 基因转录分析 | 第88-89页 |
| 4.4.8 AcStuA结合pcbAB-pcbC和cefEF-cefG启动子区调控CPC合成 | 第89-90页 |
| 4.4.9 AcstuA的缺失导致突变株在发酵过程中菌丝形态异常 | 第90-92页 |
| 4.5 讨论 | 第92-95页 |
| 第5章 顶头孢霉自噬相关基因Acatg8的功能研究 | 第95-115页 |
| 5.1 前言 | 第95-97页 |
| 5.2 材料 | 第97页 |
| 5.3 方法 | 第97-101页 |
| 5.3.1 自噬相关基因Acatg8及其cDNA的克隆 | 第97页 |
| 5.3.2 Acatg8对酵母atg8突变株的异源互补 | 第97-98页 |
| 5.3.3 Acatg8基因敲除株的构建 | 第98页 |
| 5.3.4 构建△Acatg8遗传互补株 | 第98页 |
| 5.3.5 透射电子显微镜样品制备与观察 | 第98-99页 |
| 5.3.6 WT、△Acatg8与Acatg8C分生孢子产生量比较 | 第99页 |
| 5.3.7 液体发酵和头孢菌素的测定 | 第99页 |
| 5.3.8 AcAtg8、PcbC、CefD2、线粒体及过氧化物酶体的荧光蛋白标记及荧光观察 | 第99-101页 |
| 5.4 结果 | 第101-112页 |
| 5.4.1 Acatg8基因的克隆及序列分析 | 第101-102页 |
| 5.4.2 Acatg8能够互补酵母atg8突变株 | 第102页 |
| 5.4.3 AcAtg8蛋白的定位 | 第102-103页 |
| 5.4.4 Acatg8敲除株与互补株的构建 | 第103-104页 |
| 5.4.5 Acatg8的缺失导致顶头孢霉自噬缺陷 | 第104-105页 |
| 5.4.6 Acatg8的缺失阻碍分生孢子产生 | 第105-106页 |
| 5.4.7 Acatg8的缺失影响菌株的生长 | 第106-108页 |
| 5.4.8 Acatg8的敲除能够促进顶头孢霉头孢菌素C的产量 | 第108-112页 |
| 5.5 讨论 | 第112-115页 |
| 全文总结 | 第115-117页 |
| 参考文献 | 第117-133页 |
| 附录 | 第133-137页 |
| 致谢 | 第137-139页 |
| 在读期间论文撰写情况 | 第139页 |
