| 摘要 | 第4-5页 |
| Abstract | 第5页 |
| 引言 | 第9-11页 |
| 1 细胞周期依赖激酶的克隆、表达和纯化方法的研究概况 | 第11-24页 |
| 1.1 克隆目的基因 | 第12-13页 |
| 1.1.1 目的基因的来源 | 第12页 |
| 1.1.2 目的基因的克隆 | 第12-13页 |
| 1.2 体外表达活性 CDKs 激酶复合物 | 第13-20页 |
| 1.2.1 原核表达系统制备 CDKs 激酶复合物 | 第15-19页 |
| 1.2.2 用杆状病毒表达体系制备活性 CDK-cyclin 复合物 | 第19-20页 |
| 1.3 纯化 CDKs 激酶复合物 | 第20-22页 |
| 1.3.1 原核表达的 CDKs 激酶复合物的纯化 | 第20-21页 |
| 1.3.2 杆状病毒系统表达的 CDKs 复合物的纯化 | 第21-22页 |
| 1.4 本章讨论 | 第22-24页 |
| 2 基因克隆、载体构建和定点突变 | 第24-29页 |
| 2.1 实验材料 | 第24页 |
| 2.1.1 质粒和菌株 | 第24页 |
| 2.1.2 试剂 | 第24页 |
| 2.2 实验方法 | 第24-25页 |
| 2.2.1 CDK4、cyclin D1 和 Rb 基因的克隆 | 第24页 |
| 2.2.2 重组表达载体的构建 | 第24-25页 |
| 2.2.3 定点突变 | 第25页 |
| 2.3 实验结果 | 第25-27页 |
| 2.3.1 基因克隆、载体构建 | 第25-26页 |
| 2.3.2 定点突变 | 第26-27页 |
| 2.4 本章讨论 | 第27-29页 |
| 3 诱导表达和纯化 | 第29-33页 |
| 3.1 实验材料和试剂 | 第29页 |
| 3.2 实验方法 | 第29-30页 |
| 3.2.1 诱导表达 | 第29页 |
| 3.2.2 纯化 | 第29页 |
| 3.2.3 GST 柱亲和层析纯化 | 第29页 |
| 3.2.4 镍柱亲和层析纯化 | 第29-30页 |
| 3.3 实验结果 | 第30-31页 |
| 3.3.1 诱导表达 | 第30页 |
| 3.3.2 纯化 | 第30-31页 |
| 3.4 本章讨论 | 第31-33页 |
| 4 活性 CDK4-cyclin D1 及其点突变复合物的制备 | 第33-38页 |
| 4.1 实验材料和试剂 | 第33页 |
| 4.1.1 制备细胞裂解液 | 第33页 |
| 4.1.2 CDK4-cyclin D1 及其点突变复合物的磷酸化激活 | 第33页 |
| 4.1.3 CDK4-cyclin D1 及其点突变复合物的纯化 | 第33页 |
| 4.2 实验结果 | 第33-36页 |
| 4.3 本章讨论 | 第36-38页 |
| 5 激酶活性测定 | 第38-42页 |
| 5.1 实验材料 | 第38页 |
| 5.2 实验方法 | 第38-39页 |
| 5.2.1 绘制 ATP/ADP 转化比标准曲线 | 第38页 |
| 5.2.2 检验激酶活性 | 第38页 |
| 5.2.3 测定 Fascaplysin 对 CDK4-cyclin D1 以及点突变激酶的活性抑制情况 | 第38-39页 |
| 5.3 实验结果 | 第39-41页 |
| 5.3.1 ADP/ADP 转化的标准曲线 | 第39页 |
| 5.3.2 激酶活性验证 | 第39-40页 |
| 5.3.3 CDK4-cyclin D1 激酶以及突变激酶抑制剂的 IC50 测定 | 第40-41页 |
| 5.4 本章讨论 | 第41-42页 |
| 6 分子对接 | 第42-46页 |
| 6.1 实验材料 | 第42页 |
| 6.2 实验方法 | 第42页 |
| 6.3 实验结果 | 第42-46页 |
| 6.4 本章讨论 | 第46页 |
| 7 总结 | 第46-48页 |
| 参考文献 | 第48-52页 |
| 在学研究成果 | 第52-53页 |
| 致谢 | 第53页 |
