| 摘要 | 第9-11页 |
| Abstract | 第11-12页 |
| 1 文献综述 | 第14-27页 |
| 1.1 植物基因工程研究进展及应用 | 第14页 |
| 1.2 甘蔗遗传转化的方法 | 第14-19页 |
| 1.2.1 基因枪转化法 | 第15-17页 |
| 1.2.2 农杆菌介导法 | 第17-18页 |
| 1.2.3 电击法 | 第18页 |
| 1.2.4 聚乙二醇(PEG)介导法 | 第18-19页 |
| 1.3 影响农杆菌介导单子叶植物遗传转化因素的研究 | 第19-24页 |
| 1.3.1 农杆菌菌株类型 | 第19-20页 |
| 1.3.2 植物基因型及外植体类型 | 第20-21页 |
| 1.3.3 外植体的预培养 | 第21页 |
| 1.3.4 培养基成分 | 第21-22页 |
| 1.3.5 菌液浓度及侵染时间 | 第22-23页 |
| 1.3.6 共培养时间 | 第23页 |
| 1.3.7 共培养温度和培养基pH值 | 第23页 |
| 1.3.8 受体植物的再生体系 | 第23-24页 |
| 1.4 单子叶植物常用的报告基因 | 第24-25页 |
| 1.5 植物细胞的悬浮培养 | 第25页 |
| 1.6 本研究的目的和意义 | 第25-27页 |
| 2 农杆菌侵染体系预实验 | 第27-43页 |
| 2.1 材料 | 第27-29页 |
| 2.1.1 转化受体 | 第27页 |
| 2.1.2 菌株与质粒 | 第27-28页 |
| 2.1.3 生化试剂 | 第28-29页 |
| 2.1.4 仪器设备 | 第29页 |
| 2.2 培养基 | 第29-30页 |
| 2.3 方法 | 第30-36页 |
| 2.3.1 转化受体的制备 | 第30页 |
| 2.3.2 农杆菌感受态细胞的制备和转化子的验证 | 第30-34页 |
| 2.3.2.1 农杆菌的纯化 | 第30页 |
| 2.3.2.2 农杆菌感受态细胞的制备 | 第30-31页 |
| 2.3.2.3 双元载体转化农杆菌 | 第31页 |
| 2.3.2.4 农杆菌单菌落的保存与培养 | 第31页 |
| 2.3.2.5 农杆菌转化子的鉴定 | 第31-34页 |
| 2.3.2.5.1 农杆菌转化子的PCR检测 | 第31-33页 |
| 2.3.2.5.2 农杆菌转化子的酶切鉴定 | 第33-34页 |
| 2.3.3 工程菌的制备 | 第34页 |
| 2.3.4 农杆菌转化烟草流程 | 第34页 |
| 2.3.5 转化子的筛选 | 第34页 |
| 2.3.6 GUS染色 | 第34-36页 |
| 2.3.6.1 GUS染色液的配制 | 第34-35页 |
| 2.3.6.2 烟草叶片GUS瞬时表达 | 第35-36页 |
| 2.4 结果与分析 | 第36-43页 |
| 2.4.1 农杆菌转化子的鉴定 | 第36-41页 |
| 2.4.1.1 农杆菌转化子nptⅡ基因的PCR鉴定 | 第36页 |
| 2.4.1.2 农杆菌转化子gus基因的PCR鉴定 | 第36-38页 |
| 2.4.1.3 农杆菌转化子的酶切鉴定 | 第38-41页 |
| 2.4.2 烟草叶片GUS瞬时表达分析 | 第41-43页 |
| 3 农杆菌介导甘蔗愈伤组织遗传转化技术研究 | 第43-60页 |
| 3.1 材料 | 第43页 |
| 3.1.1 甘蔗品种 | 第43页 |
| 3.1.2 转化受体 | 第43页 |
| 3.1.3 工程菌株与质粒 | 第43页 |
| 3.1.4 生化试剂 | 第43页 |
| 3.1.5 主要仪器 | 第43页 |
| 3.2 培养基 | 第43-44页 |
| 3.3 方法 | 第44-48页 |
| 3.3.1 转化受体的制备 | 第44页 |
| 3.3.1.1 甘蔗愈伤组织的诱导 | 第44页 |
| 3.3.1.2 甘蔗愈伤组织的继代 | 第44页 |
| 3.3.2 头孢霉素和Timentin的抑菌试验 | 第44-45页 |
| 3.3.2.1 抑菌圈试验 | 第44-45页 |
| 3.3.2.2 抑菌时间试验 | 第45页 |
| 3.3.2.3 头孢霉素和Timentin对共培养愈伤组织抑菌作用预试验 | 第45页 |
| 3.3.3 农杆菌感受态细胞的制备和转化子的验证 | 第45-48页 |
| 3.3.3.1 主要影响因素的实验设计 | 第45-46页 |
| 3.3.3.2 受试甘蔗品种 | 第46页 |
| 3.3.3.3 愈伤组织状态 | 第46页 |
| 3.3.3.4 愈伤组织预培养时间 | 第46页 |
| 3.3.3.5 愈伤组织化学诱导预处理 | 第46-47页 |
| 3.3.3.6 菌株的选择及培养 | 第47页 |
| 3.3.3.7 菌液浓度 | 第47页 |
| 3.3.3.8 侵染 | 第47页 |
| 3.3.3.9 共培养 | 第47-48页 |
| 3.3.3.10 筛选培养 | 第48页 |
| 3.3.4 愈伤组织GUS瞬时表达 | 第48页 |
| 3.3.4.1 GUS染色液的配制 | 第48页 |
| 3.3.4.2 愈伤组织GUS瞬时表达率分析 | 第48页 |
| 3.3.5 甘蔗抗性愈伤率分析 | 第48页 |
| 3.4 结果与分析 | 第48-56页 |
| 3.4.1 头孢霉素和Timentin固体培养对农杆菌的抑制效果比较 | 第48-52页 |
| 3.4.1.1 头孢霉素和Timentin的抑菌圈试验 | 第48-49页 |
| 3.4.1.2 头孢霉素和Timentin抑菌时间的确定 | 第49-50页 |
| 3.4.1.3 头孢霉素和Timentin对共培养愈伤组织的影响 | 第50-52页 |
| 3.4.2 不同基因型对愈伤组织GUS瞬时表达的影响 | 第52页 |
| 3.4.3 不同状态愈伤组织对GUS瞬时表达的影响 | 第52-54页 |
| 3.4.4 不同预培养时间对愈伤组织GUS瞬时表达的影响 | 第54页 |
| 3.4.5 不同化学诱导预处理对愈伤组织GUS瞬时表达的影响 | 第54-55页 |
| 3.4.6 不同菌株类型对愈伤组织GUS瞬时表达的影响 | 第55页 |
| 3.4.7 不同菌液浓度对愈伤组织GUS瞬时表达的影响 | 第55页 |
| 3.4.8 不同侵染液对愈伤组织GUS瞬时表达的影响 | 第55页 |
| 3.4.9 不同侵染时间对愈伤组织GUS瞬时表达的影响 | 第55-56页 |
| 3.4.10 不同共培养时间对愈伤组织GUS瞬时表达的影响 | 第56页 |
| 3.4.11 不同共培养温度对愈伤组织GUS瞬时表达的影响 | 第56页 |
| 3.5 讨论 | 第56-60页 |
| 3.5.1 抗生素种类和浓度的选择 | 第56页 |
| 3.5.2 基因型对遗传转化的影响 | 第56-57页 |
| 3.5.3 愈伤组织状态对遗传转化的影响 | 第57页 |
| 3.5.4 预培养对遗传转化的影响 | 第57页 |
| 3.5.5 外植体预处理对遗传转化的影响 | 第57-58页 |
| 3.5.6 农杆菌菌株侵染能力的差异 | 第58页 |
| 3.5.7 农杆菌菌液浓度和侵染时间对遗传转化的影响 | 第58页 |
| 3.5.8 共培养对遗传转化的影响 | 第58-60页 |
| 4 农杆菌介导甘蔗心叶遗传转化技术研究 | 第60-67页 |
| 4.1 材料 | 第60页 |
| 4.1.1 甘蔗品种 | 第60页 |
| 4.1.2 转化受体 | 第60页 |
| 4.1.3 工程菌株与质粒 | 第60页 |
| 4.1.4 生化试剂 | 第60页 |
| 4.1.5 主要仪器 | 第60页 |
| 4.2 培养基 | 第60页 |
| 4.3 方法 | 第60-62页 |
| 4.3.1 甘蔗心叶G418筛选浓度的确定 | 第60-61页 |
| 4.3.2 农杆菌介导的甘蔗心叶遗传转化实验设计 | 第61页 |
| 4.3.2.1 甘蔗心叶预处理 | 第61页 |
| 4.3.2.2 菌株的培养 | 第61页 |
| 4.3.2.3 侵染 | 第61页 |
| 4.3.2.4 筛选培养 | 第61页 |
| 4.3.3 心叶GUS瞬时表达率分析 | 第61-62页 |
| 4.3.3.1 GUS染色液的配制 | 第61页 |
| 4.3.3.2 心叶GUS瞬时表达率分析 | 第61-62页 |
| 4.4 结果与分析 | 第62-65页 |
| 4.4.1 甘蔗心叶G418筛选浓度的确定 | 第62-63页 |
| 4.4.2 不同基因型对心叶GUS瞬时表达的影响 | 第63-65页 |
| 4.4.3 不同预处理对心叶GUS瞬时表达的影响 | 第65页 |
| 4.5 讨论 | 第65-67页 |
| 4.5.1 G418筛选浓度对心叶存活率的影响 | 第65-66页 |
| 4.5.2 基因型和外植体类型对遗传转化的影响 | 第66-67页 |
| 5 农杆菌介导甘蔗悬浮细胞遗传转化技术研究 | 第67-75页 |
| 5.1 甘蔗悬浮细胞系的建立 | 第67-69页 |
| 5.1.1 材料 | 第67-68页 |
| 5.1.1.1 甘蔗品种 | 第67页 |
| 5.1.1.2 培养基 | 第67-68页 |
| 5.1.2 方法 | 第68-69页 |
| 5.1.2.1 甘蔗愈伤组织的诱导 | 第68页 |
| 5.1.2.2 甘蔗悬浮细胞的培养 | 第68-69页 |
| 5.1.2.2.1 悬浮培养基的优化 | 第68-69页 |
| 5.1.2.2.2 悬浮培养过程中生长曲线的测定 | 第69页 |
| 5.2 头孢霉素和Timent in的液体抑菌试验 | 第69页 |
| 5.3 农杆菌介导甘蔗悬浮细胞的遗传转化 | 第69-70页 |
| 5.3.1 培养基 | 第69页 |
| 5.3.2 农杆菌工程菌株 | 第69页 |
| 5.3.3 受体悬浮细胞的制备 | 第69-70页 |
| 5.3.4 工程菌的培养 | 第70页 |
| 5.3.5 侵染 | 第70页 |
| 5.3.6 共培养 | 第70页 |
| 5.3.7 筛选培养 | 第70页 |
| 5.4 悬浮细胞GUS瞬时表达 | 第70-71页 |
| 5.4.1 GUS染色液的配制 | 第70页 |
| 5.4.2 悬浮细胞GUS瞬时表达率分析 | 第70-71页 |
| 5.5 结果与分析 | 第71-74页 |
| 5.5.1 悬浮培养基的优化 | 第71-72页 |
| 5.5.2 悬浮细胞生长曲线的测定 | 第72页 |
| 5.5.3 头孢霉素和Timentin对农杆菌的抑制效果比较 | 第72-73页 |
| 5.5.4 不同菌液浓度和侵染时间对GUS瞬时表达的影响 | 第73-74页 |
| 5.6 讨论 | 第74-75页 |
| 5.6.1 甘蔗悬浮细胞系的建立 | 第74-75页 |
| 5.6.2 甘蔗悬浮细胞与愈伤组织和心叶GUS瞬时表达的比较 | 第75页 |
| 6 讨论 | 第75-76页 |
| 7 结论 | 第76-78页 |
| 参考文献 | 第78-86页 |
| 致谢 | 第86页 |
