| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 缩略符号对照表 | 第7-12页 |
| 第一章 绪论 | 第12-28页 |
| 1.1 多不饱和脂肪酸概述 | 第12-17页 |
| 1.1.1 多不饱和脂肪酸的结构与分类 | 第12-13页 |
| 1.1.2 多不饱和脂肪酸的功能 | 第13-14页 |
| 1.1.3 多不饱和脂肪酸的来源 | 第14-15页 |
| 1.1.4 多不饱和脂肪酸生物合成途径 | 第15-16页 |
| 1.1.5 多不饱和脂肪酸的发展现状及应用前景 | 第16-17页 |
| 1.2 Δ6 脂肪酸脱饱和酶的研究进展 | 第17-23页 |
| 1.2.1 Δ6 脂肪酸脱饱和酶在多不饱和脂肪酸生物合成途径中的重要性 | 第17页 |
| 1.2.2 Δ6 脂肪酸脱饱和酶基因的克隆与表达 | 第17-18页 |
| 1.2.3 Δ6 脂肪酸脱饱和酶的结构与功能关系 | 第18-19页 |
| 1.2.4 Δ6 脂肪酸脱饱和酶对底物的选择性 | 第19-20页 |
| 1.2.5 Δ6 脂肪酸脱饱和酶的分子改造研究 | 第20-23页 |
| 1.3 高山被孢霉脂质合成研究进展 | 第23-25页 |
| 1.3.1 高山被孢霉简介 | 第23-24页 |
| 1.3.2 高山被孢霉合成多不饱和脂肪酸 | 第24页 |
| 1.3.3 高山被孢霉的遗传改造 | 第24-25页 |
| 1.4 本课题的立题依据和意义 | 第25-26页 |
| 1.5 本课题的主要研究内容 | 第26-28页 |
| 第二章 Δ6 脂肪酸脱饱和酶的底物选择性研究 | 第28-45页 |
| 2.1 前言 | 第28页 |
| 2.2 实验材料与设备 | 第28-31页 |
| 2.2.1 供试菌株与质粒 | 第28页 |
| 2.2.2 培养基及相关溶液 | 第28-30页 |
| 2.2.3 主要试剂 | 第30页 |
| 2.2.4 主要仪器和设备 | 第30-31页 |
| 2.2.5 PCR引物 | 第31页 |
| 2.3 实验方法 | 第31-36页 |
| 2.3.1 高山被孢霉总RNA的提取及反转录 | 第31-32页 |
| 2.3.2 Δ6 脂肪酸脱饱和酶基因的获得 | 第32-33页 |
| 2.3.3 Δ6 脂肪酸脱饱和酶基因表达载体的构建 | 第33页 |
| 2.3.4 表达载体转化宿主细胞 | 第33-35页 |
| 2.3.5 酿酒酵母的诱导表达 | 第35页 |
| 2.3.6 SDS-PAGE和Western bolt分析 | 第35-36页 |
| 2.3.7 Δ6 脂肪酸脱饱和酶的活性测定 | 第36页 |
| 2.4 结果与讨论 | 第36-44页 |
| 2.4.1 Δ6 脂肪酸脱饱和酶表达载体的构建 | 第36-38页 |
| 2.4.2 Δ6 脂肪酸脱饱和酶的诱导表达和鉴定 | 第38-39页 |
| 2.4.3 Δ6 脂肪酸脱饱和酶的活性及底物选择性分析 | 第39-43页 |
| 2.4.4 Δ6 脂肪酸脱饱和酶基因的序列分析 | 第43-44页 |
| 2.5 本章小结 | 第44-45页 |
| 第三章 影响 Δ6 脂肪酸脱饱和酶底物选择性的结构区域分析 | 第45-63页 |
| 3.1 前言 | 第45页 |
| 3.2 实验材料与设备 | 第45-47页 |
| 3.2.1 供试菌株与质粒 | 第45页 |
| 3.2.2 培养基及相关溶液 | 第45-46页 |
| 3.2.3 主要试剂 | 第46页 |
| 3.2.4 主要仪器和设备 | 第46页 |
| 3.2.5 PCR引物 | 第46-47页 |
| 3.3 实验方法 | 第47-49页 |
| 3.3.1 Δ6 脂肪酸脱饱和酶功能区域划分依据 | 第47-48页 |
| 3.3.2 基于重叠延伸PCR方法的融合基因的获得 | 第48-49页 |
| 3.3.3 Δ6 脂肪酸脱饱和酶融合基因表达载体的构建 | 第49页 |
| 3.3.4 Δ6 脂肪酸脱饱和酶融合基因表达载体转化宿主细胞 | 第49页 |
| 3.3.5 酿酒酵母的诱导表达 | 第49页 |
| 3.3.6 SDS-PAGE和Western bolt分析 | 第49页 |
| 3.3.7 Δ6 脂肪酸脱饱和酶的底物浓度的选择 | 第49页 |
| 3.3.8 Δ6 脂肪酸脱饱和酶的活性测定及分析 | 第49页 |
| 3.4 结果与讨论 | 第49-62页 |
| 3.4.1 Δ6 脂肪酸脱饱和酶的多序列比对分析 | 第49-51页 |
| 3.4.2 基因重组 | 第51-52页 |
| 3.4.3 表达载体的构建 | 第52-54页 |
| 3.4.4 Δ6 脂肪酸脱饱和酶融合基因的诱导表达和鉴定 | 第54-55页 |
| 3.4.5 Δ6 脂肪酸脱饱和酶融合酶的底物选择性测定 | 第55-60页 |
| 3.4.6 Δ6 脂肪酸脱饱和酶融合酶的底物浓度的选择 | 第60-62页 |
| 3.5 本章小结 | 第62-63页 |
| 第四章 影响 Δ6 脂肪酸脱饱和酶活性的关键催化位点分析 | 第63-78页 |
| 4.1 前言 | 第63页 |
| 4.2 材料与设备 | 第63-64页 |
| 4.2.1 供试菌株和质粒 | 第63页 |
| 4.2.2 培养基及相关溶液 | 第63页 |
| 4.2.3 主要试剂 | 第63页 |
| 4.2.4 主要仪器和设备 | 第63页 |
| 4.2.5 PCR引物 | 第63-64页 |
| 4.3 实验方法 | 第64-66页 |
| 4.3.1 突变质粒的构建 | 第64-66页 |
| 4.3.2 表达载体转化宿主细胞 | 第66页 |
| 4.3.3 酿酒酵母的诱导表达 | 第66页 |
| 4.3.4 SDS-PAGE和Western bolt分析 | 第66页 |
| 4.3.5 Δ6 脂肪酸脱饱和酶突变体的活性测定 | 第66页 |
| 4.3.6 突变体的三维结构模拟 | 第66页 |
| 4.4 结果与讨论 | 第66-77页 |
| 4.4.1 同源序列比对分析及突变位点确定 | 第66-68页 |
| 4.4.2 突变体构建 | 第68-69页 |
| 4.4.3 突变基因的表达水平 | 第69-70页 |
| 4.4.4 MpFADS6中His I和His II区域的突变体的活性分析 | 第70-73页 |
| 4.4.5 MpFADS6突变体的三维结构模拟分析 | 第73-74页 |
| 4.4.6 MaFADS6-Ι 中HPGG下游位点的突变体的活性分析 | 第74-76页 |
| 4.4.7 MaFADS6-Ι 突变体的三维结构模拟分析 | 第76-77页 |
| 4.5 本章小结 | 第77-78页 |
| 第五章 细小微胞藻 Δ6 脂肪酸脱饱和酶基因在高山被孢霉中的异源表达 | 第78-89页 |
| 5.1 前言 | 第78页 |
| 5.2 材料与设备 | 第78-81页 |
| 5.2.1 供试菌株和质粒 | 第78-79页 |
| 5.2.2 培养基及相关溶液 | 第79-80页 |
| 5.2.3 主要试剂 | 第80页 |
| 5.2.4 主要仪器和设备 | 第80页 |
| 5.2.5 PCR引物 | 第80-81页 |
| 5.3 实验方法 | 第81-84页 |
| 5.3.1 质粒的构建 | 第81页 |
| 5.3.2 根癌农杆菌介导的转化 | 第81-83页 |
| 5.3.3 重组菌株的筛选和鉴定 | 第83页 |
| 5.3.4 重组菌株中MaFADS6-I基因和MpFADS6基因的相对表达水平 | 第83-84页 |
| 5.3.5 重组菌株的培养条件及脂肪酸提取与检测 | 第84页 |
| 5.4 结果与讨论 | 第84-88页 |
| 5.4.1 二元表达载体的构建 | 第84-85页 |
| 5.4.2 二元表达载体转化根癌农杆菌 | 第85-86页 |
| 5.4.3 根癌农杆菌介导转化高山被孢霉及重组菌株的筛选和鉴定 | 第86-87页 |
| 5.4.4 高山被孢霉重组菌株中MpFADS6基因的相对表达水平分析 | 第87页 |
| 5.4.5 重组菌株的脂肪酸组成分析 | 第87-88页 |
| 5.5 本章小结 | 第88-89页 |
| 第六章 高山被孢霉重组菌生产EPA条件优化 | 第89-105页 |
| 6.1 前言 | 第89页 |
| 6.2 材料与设备 | 第89-90页 |
| 6.2.1 供试菌株 | 第89-90页 |
| 6.2.2 培养基及相关溶液 | 第90页 |
| 6.2.3 主要试剂 | 第90页 |
| 6.2.4 主要仪器和设备 | 第90页 |
| 6.3 实验方法 | 第90-91页 |
| 6.3.1 重组菌株的培养条件及脂肪酸提取与检测 | 第90-91页 |
| 6.3.2 在重组菌株中外源添加游离脂肪酸、牡丹籽油和牡丹籽粕各底物的培养条件 | 第91页 |
| 6.3.3 发酵罐培养重组菌株的培养条件及发酵参数测定 | 第91页 |
| 6.4 结果与讨论 | 第91-103页 |
| 6.4.1 重组菌株在变温条件下合成EPA | 第91-93页 |
| 6.4.2 外源添加游离脂肪酸底物对重组菌合成EPA的影响 | 第93-94页 |
| 6.4.3 外源添加牡丹籽油底物对重组菌合成EPA的影响 | 第94-97页 |
| 6.4.4 外源添加牡丹籽粕汁底物对重组菌合成EPA的影响 | 第97-98页 |
| 6.4.5 分批发酵培养重组菌合成EPA | 第98-101页 |
| 6.4.6 分批补料发酵培养重组菌合成EPA | 第101-103页 |
| 6.4.7 分批发酵与分批补料发酵结果的比较 | 第103页 |
| 6.5 本章小结 | 第103-105页 |
| 主要结论与展望 | 第105-107页 |
| 主要结论 | 第105-106页 |
| 展望 | 第106-107页 |
| 创新点 | 第107-108页 |
| 致谢 | 第108-109页 |
| 参考文献 | 第109-121页 |
| 附录：作者在攻读博士学位期间发表的论文 | 第121页 |
