| 摘要 | 第3-4页 |
| Abstract | 第4页 |
| 1 前言 | 第12-19页 |
| 1.1 不可分型流感嗜血杆菌的主要致病机制 | 第12页 |
| 1.2 NTHi致病性与人纤溶酶原的关系 | 第12-15页 |
| 1.2.1 人纤溶酶原的结构和功能 | 第12-13页 |
| 1.2.2 人Plg的激活剂和抑制剂 | 第13-14页 |
| 1.2.3 NTHi利用宿主Plg致病的作用机制 | 第14-15页 |
| 1.2.4 NTHi的纤溶酶原受体 | 第15页 |
| 1.3 脂蛋白(a) | 第15-17页 |
| 1.3.1 Lp(a)的结构 | 第15-16页 |
| 1.3.2 Lp(a)的生理功能 | 第16页 |
| 1.3.3 Lp(a)与Plg之间的关系 | 第16-17页 |
| 1.4 立题依据 | 第17-19页 |
| 2 实验材料 | 第19-24页 |
| 2.1 主要仪器设备 | 第19页 |
| 2.2 化学试剂 | 第19-21页 |
| 2.3 质粒和菌株 | 第21页 |
| 2.4 PCR引物 | 第21页 |
| 2.5 常用溶液 | 第21-22页 |
| 2.6 亲和层析填料及洗脱缓冲液 | 第22页 |
| 2.7 电泳试剂的配制 | 第22-23页 |
| 2.8 转膜缓冲液的配制 | 第23页 |
| 2.9 培养基的配制 | 第23-24页 |
| 3 实验方法 | 第24-40页 |
| 3.1 rASP、rASP△K两种重组蛋白的表达与纯化 | 第24-35页 |
| 3.1.1 NTHi(ATCC49247)基因组DNA的提取 | 第24-25页 |
| 3.1.2 琼脂糖凝胶电泳 | 第25-26页 |
| 3.1.3 ASP、ASP△K基因的扩增 | 第26-27页 |
| 3.1.4 ASP、ASP△K基因扩增产物的纯化 | 第27页 |
| 3.1.5 ASP、ASP△K基因片段的酶切与纯化 | 第27-28页 |
| 3.1.6 pASK-IBA37质粒的提取 | 第28-29页 |
| 3.1.7 pASK-IBA37载体的酶切与纯化 | 第29-30页 |
| 3.1.8 酶切后的ASP基因片段与pASK-IBA37载体的连接 | 第30页 |
| 3.1.9 酶切后的ASP△K基因片段与pASK-IBA37载体的连接 | 第30页 |
| 3.1.10 ASP基因与pASK-IBA37载体连接产物的转化和抗性筛选 | 第30页 |
| 3.1.11 ASP△K基因与pASK-IBA37载体连接产物的转化和抗性筛选 | 第30页 |
| 3.1.12 菌落PCR鉴定阳性菌落 | 第30-31页 |
| 3.1.13 阳性菌落的扩大培养及菌种保存 | 第31页 |
| 3.1.14 阳性克隆中重组质粒的提取、鉴定 | 第31-32页 |
| 3.1.15 基因序列的测定 | 第32页 |
| 3.1.16 工程菌的培养 | 第32页 |
| 3.1.17 表达产物的SDS-PAGE分析 | 第32-33页 |
| 3.1.18 rASP、rASP△K的纯化 | 第33-34页 |
| 3.1.19 浓缩后的rASP、rASP△K的Western blot检测 | 第34页 |
| 3.1.20 rASP、rASP△K浓度的测定 | 第34页 |
| 3.1.21 rASP、rASP△K活性的测定 | 第34-35页 |
| 3.2 rASP与Lp(a)、LDL的结合实验(ELISA) | 第35-36页 |
| 3.3 Lp(a)与rASP结合机制的研究 | 第36-39页 |
| 3.3.1 Lp(a)与rASP、rASP△K的结合(ELISA) | 第36页 |
| 3.3.2 EACA对Lp(a)与rASP结合的抑制作用(ELISA) | 第36-37页 |
| 3.3.3 rASP、rASP△K与血浆Lp(a)结合的亲和层析试验 | 第37-38页 |
| 3.3.4 rASP、rASP△K与血浆Lp(a)、纯Lp(a)的结合试验(ELISA) | 第38-39页 |
| 3.4 Plg与rASP、rASP△K的结合试验(ELISA) | 第39页 |
| 3.5 Lp(a)对Plg与rASP结合的抑制作用(Binding-inhibition ELISA) | 第39-40页 |
| 4 结果与分析 | 第40-56页 |
| 4.1 pASK-IBA37-ASP及pASK-IBA37-ASP△K表达载体的构建 | 第40-45页 |
| 4.1.1 NTHi(ATCC49247)基因组的提取 | 第40-41页 |
| 4.1.2 ASP基因的扩增 | 第41页 |
| 4.1.3 ASP△K基因的扩增 | 第41页 |
| 4.1.4 pASK-IBA37载体的酶切及纯化 | 第41-42页 |
| 4.1.5 ASP基因的酶切、连接和转化结果的鉴定 | 第42-43页 |
| 4.1.6 ASP△K基因的酶切、连接和转化结果的鉴定 | 第43-44页 |
| 4.1.7 ASP、ASP△K基因序列测定结果 | 第44-45页 |
| 4.2 rASP、ASP△K的诱导表达、纯化、含量及活性的测定 | 第45-50页 |
| 4.2.1 rASP蛋白的诱导表达 | 第45页 |
| 4.2.2 rASP蛋白的纯化 | 第45-47页 |
| 4.2.3 rASP△K蛋白的诱导表达 | 第47页 |
| 4.2.4 rASP△K蛋白的纯化 | 第47-49页 |
| 4.2.5 纯化、浓缩后重组蛋白的Western Blot检测 | 第49页 |
| 4.2.6 rASP、rASP△K蛋白含量的测定 | 第49-50页 |
| 4.2.7 rASP、rASP△K蛋白活性的测定 | 第50页 |
| 4.3 rASP与Lp(a)结合作用及结合机制的研究 | 第50-54页 |
| 4.3.1 rASP与Lp(a)、LDL的结合试验 | 第50-51页 |
| 4.3.2 EACA对Lp(a)与rASP结合的抑制作用 | 第51-52页 |
| 4.3.3 rASP、rASP△K与Lp(a)的结合试验 | 第52页 |
| 4.3.4 rASP、rASP△K与血浆Lp(a)结合的亲和层析实验 | 第52-53页 |
| 4.3.5 rASP、rASP△K与血浆Lp(a)、纯Lp(a)的结合试验 | 第53-54页 |
| 4.4 Plg与rASP、rASP△K的结合试验 | 第54-55页 |
| 4.5 Lp(a)对rASP与Plg结合抑制作用 | 第55-56页 |
| 5 讨论 | 第56-57页 |
| 6 结论 | 第57-58页 |
| 致谢 | 第58-59页 |
| 参考文献 | 第59-66页 |
| 附录 | 第66-71页 |
| 作者简介 | 第71页 |
