| 中文摘要 | 第1-7页 |
| Abstract | 第7-12页 |
| 目录 | 第12-15页 |
| 第一章 文献综述 | 第15-39页 |
| 1 Piwi基因的研究进展 | 第15-22页 |
| ·Argonaute蛋白家族 | 第15页 |
| ·Piwi基因的发现 | 第15-16页 |
| ·Piwi基因的生物学功能 | 第16-19页 |
| ·PIWI蛋白与非编码小RNA | 第19-22页 |
| 2 鸡基因组转座子概述 | 第22-24页 |
| 3 禽类精子发生 | 第24-25页 |
| ·禽类的生殖器官 | 第24页 |
| ·精子发生 | 第24-25页 |
| 4 真核生物基因的转录调控研究 | 第25-28页 |
| ·真核生物基因的转录调控元件 | 第25-27页 |
| ·真核生物基因的转录调控研究 | 第27-28页 |
| 5 RNA干扰技术 | 第28-31页 |
| ·RNAi的发现 | 第29页 |
| ·RNAi的作用机制 | 第29-30页 |
| ·RNAi技术 | 第30-31页 |
| 6 实时定量PCR技术 | 第31-37页 |
| ·Real-Time qPCR的几个常用术语 | 第32-34页 |
| ·Real-Time qPCR的检测方法 | 第34-36页 |
| ·Real-Time qPCR的数据分析方法 | 第36-37页 |
| 7 本研究的目的和意义 | 第37-39页 |
| 第二章 鸡Piwil1基因的克隆及其时空表达分析 | 第39-61页 |
| 1 引言 | 第39页 |
| 2 实验材料 | 第39-40页 |
| ·实验动物 | 第39页 |
| ·主要仪器 | 第39页 |
| ·主要试剂 | 第39-40页 |
| 3 实验方法 | 第40-50页 |
| ·样品采集与保存 | 第40页 |
| ·鸡原始生殖细胞(PGCs)的分离与鉴定 | 第40-41页 |
| ·鸡精原干细胞(SSCs)的分离与鉴定 | 第41页 |
| ·鸡睾丸生精细胞的分离与鉴定 | 第41页 |
| ·鸡成熟精子的纯化 | 第41-42页 |
| ·基因组DNA提取与质量检测 | 第42页 |
| ·性别鉴定 | 第42-43页 |
| ·总RNA提取与质量检测 | 第43页 |
| ·RT-PCR | 第43-44页 |
| ·TA克隆 | 第44-45页 |
| ·RACE | 第45-47页 |
| ·Real-Time qPCR | 第47-48页 |
| ·生物信息学分析 | 第48-49页 |
| ·数据分析 | 第49-50页 |
| 4 结果与分析 | 第50-59页 |
| ·鸡PGCs的鉴定结果 | 第50页 |
| ·鸡SSCs的鉴定结果 | 第50-51页 |
| ·鸡睾丸精原(母)细胞的鉴定结果 | 第51-52页 |
| ·鸡Piwil1基因的克隆及其生物信息学分析 | 第52-54页 |
| ·鸡Piwil1基因的组织、细胞表达特异性 | 第54-56页 |
| ·Piwil1基因在狼山鸡不同发育阶段不同组织的表达量分析 | 第56-58页 |
| ·Piwil1基因在狼山鸡胚胎期性腺组织中的表达量分析 | 第58-59页 |
| 5 讨论 | 第59-61页 |
| 第三章 鸡Piwil1基因的转录调控分析 | 第61-74页 |
| 1 引言 | 第61页 |
| 2 实验材料 | 第61-62页 |
| ·实验动物 | 第61页 |
| ·主要仪器 | 第61页 |
| ·主要试剂 | 第61-62页 |
| 3 实验方法 | 第62-67页 |
| ·基因组DNA提取与质量检测 | 第62页 |
| ·Piwil1基因启动子区系列缺失片段的扩增 | 第62-63页 |
| ·克隆测序 | 第63页 |
| ·Piwil1基因启动子区系列缺失片段表达载体的构建 | 第63-65页 |
| ·定点突变表达载体的构建 | 第65-66页 |
| ·无内毒素质粒的提取 | 第66页 |
| ·细胞转染 | 第66-67页 |
| ·荧光素酶活性检测 | 第67页 |
| ·数据处理 | 第67页 |
| 4 结果与分析 | 第67-72页 |
| ·Piwil1基因启动子区系列缺失片段表达载体的鉴定 | 第67-68页 |
| ·细胞转染条件的优化 | 第68-70页 |
| ·Piwil1基因启动子活性分析 | 第70页 |
| ·CCAAT box和TCCC box转录元件的定点突变分析 | 第70-72页 |
| 5 讨论 | 第72-74页 |
| 第四章 体外抑制鸡Piwil1基因的表达对转座子活性的影响 | 第74-97页 |
| 1 引言 | 第74页 |
| 2 实验材料 | 第74-75页 |
| ·实验动物 | 第74页 |
| ·主要仪器 | 第74页 |
| ·主要试剂 | 第74-75页 |
| 3 实验方法 | 第75-86页 |
| ·pcDNA3.1(+)-Piwil1表达载体的构建 | 第75页 |
| ·Piwil1基因shRNA干扰表达载体的构建 | 第75-77页 |
| ·Piwil1基因miRNA干扰慢病毒表达载体的构建 | 第77-81页 |
| ·无内毒素质粒的提取 | 第81页 |
| ·慢病毒包装 | 第81-82页 |
| ·慢病毒滴度测定 | 第82页 |
| ·miRNA干扰质粒和高表达质粒共转染HEK293细胞 | 第82-83页 |
| ·质粒转染及慢病毒侵染HEK293细胞 | 第83页 |
| ·shRNA干扰质粒瞬时转染鸡PGCs细胞 | 第83页 |
| ·Western Blot检测 | 第83-85页 |
| ·细胞间接免疫荧光检测 | 第85页 |
| ·Real-Time qPCR | 第85-86页 |
| ·数据分析 | 第86页 |
| 4 结果与分析 | 第86-94页 |
| ·pcDNA3.1(+)-Piwil1表达载体的鉴定 | 第86页 |
| ·PIWIL1蛋白的细胞内表达 | 第86-88页 |
| ·miRNA干扰表达载体干扰效果的筛选 | 第88-90页 |
| ·慢病毒包装与滴度测定 | 第90-92页 |
| ·慢病毒干扰效果的初步验证 | 第92页 |
| ·体外抑制鸡Piwil1基因的表达对CR1转座子活性的影响 | 第92-94页 |
| 5 讨论 | 第94-97页 |
| 第五章 鹌鹑Piwil1基因克隆和piRNAs的表达谱研究 | 第97-114页 |
| 1 引言 | 第97页 |
| 2 实验材料 | 第97-98页 |
| ·实验动物 | 第97页 |
| ·主要仪器 | 第97页 |
| ·主要试剂 | 第97-98页 |
| 3 实验方法 | 第98-103页 |
| ·样品采集与保存 | 第98页 |
| ·总RNA提取与质量检测 | 第98页 |
| ·RT-PCR | 第98页 |
| ·RACE | 第98页 |
| ·Northern Blot检测 | 第98-101页 |
| ·Western Blot检测 | 第101页 |
| ·免疫沉淀反应 | 第101-102页 |
| ·Small RNA cDNA文库的制备与Solexa测序 | 第102-103页 |
| ·生物信息学分析 | 第103页 |
| 4 结果与分析 | 第103-112页 |
| ·鹌鹑Piwil1基因的克隆与生物信息学分析 | 第103-105页 |
| ·鹌鹑Piwil1基因的组织表达特异性 | 第105-106页 |
| ·Small RNAs深度测序数据概述 | 第106-108页 |
| ·piRNAs比对分析 | 第108-112页 |
| 5 讨论 | 第112-114页 |
| 全文结论 | 第114-115页 |
| 参考文献 | 第115-128页 |
| 致谢 | 第128-129页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 | 第129-131页 |
