| 摘要 | 第1-19页 |
| Abstract | 第19-21页 |
| 主要英文縮写与译名 | 第21-22页 |
| 第一章 文献综述 | 第22-59页 |
| 1 猪圆环病毒 | 第22-32页 |
| ·猪圆环病毒的发现 | 第22-24页 |
| ·猪圆环病毒的形态学和理化性质 | 第24-25页 |
| ·猪圆环病毒的基因组结构及其编码蛋白 | 第25-29页 |
| ·Rep蛋白 | 第27-28页 |
| ·Cap蛋白 | 第28页 |
| ·ORF3蛋白 | 第28-29页 |
| ·其他ORFs编码蛋白 | 第29页 |
| ·与猪圆环病毒相关的疾病 | 第29-30页 |
| ·猪圆环病毒病的疫苗研究 | 第30-31页 |
| ·猪圆环病毒研究的展望 | 第31-32页 |
| 2 猪繁殖与呼吸综合征病毒 | 第32-41页 |
| ·猪繁殖与呼吸综合征病毒的发现 | 第32-33页 |
| ·猪繁殖与呼吸综合征病毒的形态学和理化性质 | 第33-34页 |
| ·猪繁殖与呼吸综合征病毒的基因组结构及其编码蛋白 | 第34-37页 |
| ·ORF5编码蛋白 | 第36页 |
| ·ORF6编码蛋白 | 第36-37页 |
| ·猪繁殖与呼吸综合征病毒的受体与病毒复制 | 第37-38页 |
| ·猪繁殖与呼吸综合征疫苗研究 | 第38-40页 |
| ·猪繁殖与呼吸综合征疫苗研究特殊性 | 第38页 |
| ·猪繁殖与呼吸综合征弱毒疫苗 | 第38-39页 |
| ·猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗 | 第39页 |
| ·猪繁殖与呼吸综合征DNA疫苗 | 第39-40页 |
| ·猪繁殖与呼吸综合征活载体疫苗 | 第40页 |
| ·猪繁殖与呼吸综合征研究的展望 | 第40-41页 |
| 3 家蚕核型多角体病毒 | 第41-47页 |
| ·杆状病毒概况 | 第41页 |
| ·杆状病毒的分类和理化性质 | 第41-42页 |
| ·家蚕核型多角体病毒基因组及其表达 | 第42-44页 |
| ·家蚕核型多角体病毒RNA干扰研究进展 | 第44-46页 |
| ·shRNA干扰家蚕核型多角体病毒研究的展望 | 第46-47页 |
| 4 RNA干扰 | 第47-55页 |
| ·RNA干扰现象的发现 | 第47-50页 |
| ·共抑制现象的发现 | 第47-48页 |
| ·RNA干扰现象的发现 | 第48-50页 |
| ·shRNA干扰基本原理 | 第50-53页 |
| ·shRNA干扰 | 第50-51页 |
| ·shRNA靶序列的选择 | 第51页 |
| ·shRNA靶序列的设计 | 第51页 |
| ·shRNA介导的沉默机制 | 第51-53页 |
| ·RNAi技术应用于病毒性疾病治疗研究现状 | 第53-54页 |
| ·RNA干扰的局限性 | 第54-55页 |
| 5 PiggyBac转座子 | 第55-57页 |
| ·转座子 | 第55页 |
| ·piggyBac转座子 | 第55-56页 |
| ·piggyBac转座子的应用 | 第56-57页 |
| 6 技术路线 | 第57-59页 |
| ·shRNA的设计合成与活性筛选 | 第57页 |
| ·转基因细胞系建立与鉴定 | 第57-59页 |
| 第二章 一般材料与方法 | 第59-75页 |
| 1 试验材料 | 第59-60页 |
| ·生物材料 | 第59页 |
| ·工具酶和主要试剂 | 第59-60页 |
| ·试剂盒 | 第60页 |
| 2 主要试剂配制 | 第60-62页 |
| 3 主要试验仪器 | 第62-63页 |
| 4 常用试验方法 | 第63-75页 |
| ·连接产物转化 | 第63页 |
| ·小量质粒DNA的制备 | 第63-64页 |
| ·重组质粒琼脂糖凝胶电泳鉴定 | 第64页 |
| ·目的片段的分离回收 | 第64-65页 |
| ·细胞的培养与保存 | 第65-66页 |
| ·细胞活化 | 第66页 |
| ·细胞转染 | 第66-67页 |
| ·细胞基因组DNA提取 | 第67-68页 |
| ·培养细胞总RNA提取 | 第68-70页 |
| ·反转录 | 第70页 |
| ·Real-Time PCR | 第70-72页 |
| ·Splinkerette-PCR | 第72-75页 |
| 第三章 shRNA干扰猪圆环状病毒增殖和复制研究 | 第75-98页 |
| 第一节 针对PVC2型病毒的shRNA的设计与合成 | 第75-85页 |
| 摘要 | 第75页 |
| 1 材料与方法 | 第75-76页 |
| ·材料 | 第75页 |
| ·方法 | 第75-76页 |
| ·针对PVC2病毒的shRNA的设计 | 第75页 |
| ·双链shRNA合成方法 | 第75-76页 |
| 2 结果与分析 | 第76-85页 |
| ·抗猪圆环病毒病shRNA的设计原则 | 第76页 |
| ·针对PVC2病毒-Rep蛋白基因的shRNA设计 | 第76-80页 |
| ·针对PVC2病毒-Cap蛋白基因的shRNA设计 | 第80-84页 |
| ·针对PVC2病毒-ORF3/ORF4基因的shRNA设计 | 第84-85页 |
| 第二节 针对PVC2病毒shRNA的活性筛选 | 第85-98页 |
| 摘要 | 第85-86页 |
| 1 材料与方法 | 第86-89页 |
| ·材料 | 第86页 |
| ·方法 | 第86-89页 |
| ·PK15细胞的复苏与培养 | 第86页 |
| ·表达特异性含猪圆环病病毒靶向基因shRNA重组质粒的构建 | 第86-87页 |
| ·重组质粒酶切鉴定 | 第87页 |
| ·重组质粒测序鉴定 | 第87-88页 |
| ·转染 | 第88页 |
| ·病毒感染 | 第88页 |
| ·表达特异性shRNA载体对PCV2复制增殖的干扰效果 | 第88-89页 |
| 2 结果与分析 | 第89-96页 |
| ·载体构建与鉴定 | 第89页 |
| ·pSIREN-shRNA重组质粒转染PK15细胞效率检测 | 第89-90页 |
| ·针对PVC2病毒-Rep蛋白基因的shRNA的活性筛选 | 第90-93页 |
| ·针对PVC2病毒-Cap蛋白基因的shRNA的活性筛选 | 第93-95页 |
| ·针对PVC2病毒-ORF3/ORF4基因的shRNA的效果检测 | 第95-96页 |
| 3 讨论 | 第96-98页 |
| 第四章 shRNA干扰猪繁殖与呼吸综合症病毒增殖和复制的研究 | 第98-126页 |
| 第一节 针对PRRSV靶向基因的shRNA的设计与合成 | 第98-101页 |
| 摘要 | 第98页 |
| 1 材料与方法 | 第98-99页 |
| ·材料 | 第98页 |
| ·方法 | 第98-99页 |
| ·针对PRRSV靶向基因shRNA的设计 | 第98-99页 |
| ·双链shRNA合成方法 | 第99页 |
| 2 结果与分析 | 第99-101页 |
| ·抗猪蓝耳病病毒病shRNA的设计原则 | 第99页 |
| ·针对PRRSV-ORF5的shRNA设计 | 第99-100页 |
| ·针对PRRSV-ORF6的shRNA设计 | 第100-101页 |
| 第二节 抗猪蓝耳病病毒shRNA活性的检测 | 第101-106页 |
| 摘要 | 第101页 |
| 1 材料与方法 | 第101-104页 |
| ·材料 | 第101页 |
| ·方法 | 第101-104页 |
| ·Marc-145细胞的复苏与培养 | 第101-102页 |
| ·表达特异性含猪蓝耳病病毒靶向基因shRNA重组质粒的构建 | 第102页 |
| ·重组质粒酶切鉴定 | 第102页 |
| ·重组质粒测序鉴定 | 第102-103页 |
| ·病毒的培养 | 第103页 |
| ·转染 | 第103页 |
| ·病毒感染 | 第103页 |
| ·表达特异性shRNA载体对PRRSV复制增殖的干扰效果 | 第103-104页 |
| 2 结果与分析 | 第104-106页 |
| ·载体构建与鉴定 | 第104-105页 |
| ·pSIREN-shRNA重组质粒转染Marc-145细胞效率检测 | 第105页 |
| ·抗猪蓝耳病病毒shRNA活性的检测 | 第105-106页 |
| 第三节 转基因载体构建 | 第106-111页 |
| 摘要 | 第106页 |
| 1 材料与方法 | 第106-109页 |
| ·材料 | 第106-107页 |
| ·方法 | 第107-109页 |
| ·PXL-BAC Ⅱ-ZsGFP载体构建 | 第107-108页 |
| ·PXL-BAC Ⅱ-ZsGFP-Neo载体构建 | 第108页 |
| ·PXL-BAC Ⅱ-FRT-ZsGFP-Neo-shRNA载体构建 | 第108-109页 |
| 2 结果与分析 | 第109-111页 |
| ·PXL-BAC Ⅱ-FRT-ZsGFP-Neo-shRNA(6e)重组质粒载体构建 | 第109-110页 |
| ·PXL-BAC Ⅱ-FRT-ZsGFP-Neo-6e酶切鉴定 | 第110-111页 |
| 第四节 抗PRRSV转基因细胞系的建立 | 第111-115页 |
| 摘要 | 第111页 |
| 1 材料与方法 | 第111-113页 |
| ·材料 | 第111页 |
| ·方法 | 第111-113页 |
| ·通过不同浓度的G418筛选培养基确定Marc-145对G418的敏感度 | 第111-112页 |
| ·质粒稳定转染 | 第112页 |
| ·单克隆细胞的筛选 | 第112-113页 |
| 2 结果与分析 | 第113-115页 |
| ·Marc-145细胞最佳筛选浓度 | 第113页 |
| ·转基因载体转染Marc-145细胞的效率检测 | 第113-114页 |
| ·转基因细胞系筛选 | 第114-115页 |
| 第五节 Marc-145转基因细胞的鉴定 | 第115-126页 |
| 摘要 | 第115-116页 |
| 1 材料与方法 | 第116-120页 |
| ·材料 | 第116页 |
| ·方法 | 第116-120页 |
| ·单克隆细胞基因组PCR | 第117页 |
| ·单克隆细胞RT-PCR | 第117-118页 |
| ·Dot Blotting | 第118-119页 |
| ·插入位点检测-Splinkerette-PCR | 第119页 |
| ·转基因细胞系的抗病毒能力 | 第119-120页 |
| 2 结果与分析 | 第120-125页 |
| ·细胞基因组PCR标记基因和筛选基因的检测 | 第120-121页 |
| ·逆转录PCR | 第121-122页 |
| ·Dot blotting | 第122-123页 |
| ·Splinkerette-PCR分析外源基因插入位点 | 第123-124页 |
| ·转基因细胞抗病毒能力 | 第124-125页 |
| 3 讨论 | 第125-126页 |
| 第五章 shRNA干扰家蚕BmNPV增殖与复制的研究 | 第126-158页 |
| 第一节 针对BmNPV靶向基因shRNA的设计与合成 | 第126-130页 |
| 摘要 | 第126页 |
| 1 材料与方法 | 第126-127页 |
| ·材料 | 第126页 |
| ·方法 | 第126-127页 |
| ·针对BmNPV靶向基因shRNA的设计 | 第126-127页 |
| ·双链shRNA的合成 | 第127页 |
| 2 结果与分析 | 第127-130页 |
| ·针对BmNPV极早期表达因子ie-1基因的shRNA设计 | 第127-128页 |
| ·针对BmNPV晚期表达因子lef-1基因的shRNA设计 | 第128-129页 |
| ·针对BmNPV晚期表达因子lef-2基因的shRNA设计 | 第129页 |
| ·针对BmNPV晚期表达因子lef-3基因的shRNA设计 | 第129-130页 |
| 第二节 针对BmNPV的shRNA的活性筛选 | 第130-139页 |
| 摘要 | 第130页 |
| 1 材料与方法 | 第130-134页 |
| ·材料 | 第130页 |
| ·方法 | 第130-134页 |
| ·BmN的复苏与培养 | 第130页 |
| ·PXL-BACⅡ-GFP载体的构建 | 第130-131页 |
| ·PXL-BACⅡ-GFP-BmU6载体构建 | 第131-132页 |
| ·PXL-BACⅡ-GFP-BmU6-shRNA重组质粒构建 | 第132页 |
| ·BmNPV病毒的复苏与增殖 | 第132页 |
| ·BmNPV的CCID50测定 | 第132-133页 |
| ·表达特异性shRNA重组质粒PXL-BACⅡ-GFP-BmU6-shRNA活性筛选 | 第133-134页 |
| 2 结果与分析 | 第134-139页 |
| ·GFP基因扩增 | 第134页 |
| ·BmU6扩增 | 第134-136页 |
| ·PXL-BACⅡ-GFP-BmU6-shRNA重组质粒 | 第136-137页 |
| ·转染与病毒接种 | 第137-138页 |
| ·针对BmNPV靶基因的shRNA的活性筛选 | 第138-139页 |
| 第三节 单联与双联转基因载体构建 | 第139-145页 |
| 摘要 | 第139-140页 |
| 1 材料与方法 | 第140-142页 |
| ·材料 | 第140页 |
| ·方法 | 第140-142页 |
| ·Neomycin筛选基因的获取 | 第140页 |
| ·PXL-BACⅡ-GFP-BmU6-shRNA-Neo的构建 | 第140-141页 |
| ·双联载体的构建 | 第141-142页 |
| 2 结果与分析 | 第142-145页 |
| ·Neomycinr基因的扩增 | 第142-143页 |
| ·PXL-BACⅡ-GFP-BmU6-shRNA-Neo重组质粒酶切鉴定 | 第143-144页 |
| ·双联载体构建 | 第144-145页 |
| 第四节 抗BmNPV转基因细胞系的建立 | 第145-148页 |
| 摘要 | 第145页 |
| 1 材料与方法 | 第145-147页 |
| ·材料 | 第145页 |
| ·方法 | 第145-147页 |
| ·通过不同浓度的G418筛选培养基确定BmN对G418的敏感度 | 第145-146页 |
| ·质粒稳定转染 | 第146页 |
| ·单克隆细胞的筛选 | 第146-147页 |
| 2 结果与分析 | 第147-148页 |
| ·BmN细胞最佳筛选浓度 | 第147页 |
| ·转基因细胞系筛选 | 第147-148页 |
| 第五节 BmN转基因细胞的鉴定 | 第148-158页 |
| 摘要 | 第148-149页 |
| 1 材料与方法 | 第149-151页 |
| ·材料 | 第149页 |
| ·方法 | 第149-151页 |
| ·双联重组转座载体PXL-BACⅡ-GFP-double(ielc/lef3e2)-Neo抗病毒能力 | 第149页 |
| ·PXL-BACⅡ-GFP-BmU6-shRNA(ielc)-Neo转基因细胞的抗病毒能力 | 第149-150页 |
| ·单克隆细胞基因组PCR | 第150页 |
| ·单克隆细胞RT-PCR | 第150-151页 |
| ·转座插入位点检测-Splinkerette-PCR | 第151页 |
| 2 结果与分析 | 第151-156页 |
| ·PXL-BACⅡ-GFP-BmU6-shRNA(ielc)-Neo转基因细胞抗病毒能力 | 第151-152页 |
| ·双联重组转座质粒抗病毒能力 | 第152-153页 |
| ·细胞基因组PCR | 第153-154页 |
| ·逆转录PCR | 第154页 |
| ·Splinkerette-PCR分析外源基因插入位点 | 第154-156页 |
| 3 讨论 | 第156-158页 |
| 第六章 总结 | 第158-161页 |
| 1 主要结论 | 第158-159页 |
| 2 创新点 | 第159页 |
| 3 后续研究展望 | 第159-161页 |
| 参考文献 | 第161-180页 |
| 攻读博士期间发表论文 | 第180-182页 |
| 申请国家发明专利 | 第182-184页 |
| 攻读博士期间参加课题 | 第184-185页 |
| 致谢 | 第185页 |
