| 摘要 | 第1-13页 |
| Abstract | 第13-16页 |
| 缩略语表(Abbreviation) | 第16-18页 |
| 第一部分 西尼罗病毒流行病学及检测技术研究现状(综述) | 第18-37页 |
| 1 西尼罗病毒生物学特性的研究 | 第18-22页 |
| ·西尼罗病毒的分类 | 第18-19页 |
| ·西尼罗病毒的形态学特征 | 第19-20页 |
| ·西尼罗病毒的基因组结构 | 第20-21页 |
| ·西尼罗病毒基因组编码的蛋白及功能 | 第21-22页 |
| ·结构蛋白与功能 | 第21-22页 |
| ·非结构蛋白与功能 | 第22页 |
| 2 西尼罗病毒的流行病学特征及防制现状 | 第22-28页 |
| ·西尼罗病毒的传染源 | 第22页 |
| ·西尼罗病毒的传播途径 | 第22-23页 |
| ·西尼罗病毒的易感者 | 第23-24页 |
| ·易感人群 | 第23-24页 |
| ·易感动物 | 第24页 |
| ·西尼罗病毒近年流行特点分析 | 第24-28页 |
| ·发病率与死亡率的上升 | 第24页 |
| ·流行地域的扩展 | 第24-25页 |
| ·广泛的鸟类动物宿主 | 第25-26页 |
| ·广泛的蚊虫媒介 | 第26-27页 |
| ·多种哺乳动物被感染发病死亡 | 第27-28页 |
| ·防止西尼罗病毒感染的预防措施 | 第28页 |
| 3 西尼罗病毒检测技术研究进展 | 第28-36页 |
| ·病毒分离接种法 | 第28-29页 |
| ·空斑形成试验 | 第29页 |
| ·免疫学检测方法 | 第29-32页 |
| ·免疫荧光法 | 第29-30页 |
| ·酶联免疫吸附法 | 第30页 |
| ·免疫组织化学法 | 第30页 |
| ·生物条形码检测法 | 第30-32页 |
| ·核酸检测方法 | 第32-36页 |
| ·常规RT-PCR | 第32页 |
| ·巢式RT-PCR | 第32页 |
| ·实时荧光定量PCR | 第32-34页 |
| ·核酸序列扩增分析 | 第34-35页 |
| ·环介导的恒温扩增技术 | 第35-36页 |
| 4 展望 | 第36-37页 |
| 第二部分 西尼罗病毒易感性研究现状(综述) | 第37-44页 |
| 1 WNV主要突变位点与易感性之间的关系 | 第37-40页 |
| ·结构蛋白功能与突变 | 第37-39页 |
| ·非结构蛋白功能与突变 | 第39-40页 |
| ·NS2蛋白的突变 | 第39页 |
| ·NS5蛋白的突变 | 第39页 |
| ·NS1蛋白基因相对保守 | 第39-40页 |
| ·NS2B和NS3蛋白 | 第40页 |
| 2 WNV易感性与感染机体状态及相关因子之间的关系 | 第40-42页 |
| ·WNV易感性与年龄之间的关系 | 第40页 |
| ·WNV易感性与OAS及CCR5之间的关系 | 第40-42页 |
| ·WNV易感性与CXCL10之间的关系 | 第42页 |
| 3 展望 | 第42-44页 |
| 第三部分 西尼罗病毒荧光定量PCR检测体系的建立与评价 | 第44-58页 |
| 1 研究目的与意义 | 第45页 |
| 2 材料与方法 | 第45-49页 |
| ·试剂 | 第45页 |
| ·病毒与样本 | 第45页 |
| ·主要仪器 | 第45-46页 |
| ·靶序列选择及引物的设计 | 第46页 |
| ·WNV基因组RNA的提取及cDNA的合成 | 第46页 |
| ·标准品对照片段的扩增、克隆与定量 | 第46-47页 |
| ·引物浓度的优化 | 第47-48页 |
| ·标准品的扩增及标准扩增曲线的绘制 | 第48页 |
| ·检测体系特异性的确定 | 第48页 |
| ·检测体系的灵敏度及定量线性分析 | 第48页 |
| ·重复性检测 | 第48-49页 |
| 3 结果 | 第49-55页 |
| ·引物的Blast比对结果 | 第49-50页 |
| ·标准品对照扩增结果 | 第50-51页 |
| ·对照PCR扩增结果 | 第51-52页 |
| ·引物使用浓度的确定 | 第52页 |
| ·标准品对照质粒扩增曲线及标准回归曲线的分析 | 第52-53页 |
| ·标准品熔解曲线分析 | 第53-54页 |
| ·检测体系灵敏感度及特异性分析 | 第54页 |
| ·重复性检测结果 | 第54-55页 |
| 4 讨论 | 第55-56页 |
| ·基于SYBR Green Ⅰ建立的检测体系特点分析 | 第55-56页 |
| ·本研究建立的体系优缺点分析 | 第56页 |
| ·建立的RT-PCR检测体系应用前景分析 | 第56页 |
| 5 结论 | 第56-58页 |
| 第四部分 西尼罗病毒E蛋白结构域Ⅲ在S2细胞中的表达与鉴定 | 第58-76页 |
| 1 研究目的与意义 | 第59页 |
| 2 材料与方法 | 第59-68页 |
| ·材料 | 第59-60页 |
| ·细胞株 | 第59页 |
| ·载体与基因 | 第59页 |
| ·酶类及试剂 | 第59-60页 |
| ·细胞培养用品 | 第60页 |
| ·DNA和蛋白标准参照物 | 第60页 |
| ·主要仪器、设备 | 第60页 |
| ·表达载体pMT/DⅢ的构建 | 第60-63页 |
| ·E DomainⅢ基因的PCR扩增 | 第60-61页 |
| ·DomainⅢ基因的亚克隆 | 第61页 |
| ·载体构建 | 第61-62页 |
| ·质粒的提取 | 第62-63页 |
| ·重组质粒的鉴定 | 第63页 |
| ·双酶切鉴定 | 第63页 |
| ·PCR鉴定 | 第63页 |
| ·序列分析 | 第63页 |
| ·果蝇S2细胞的培养 | 第63-64页 |
| ·生长条件 | 第63-64页 |
| ·冻存细胞 | 第64页 |
| ·传代 | 第64页 |
| ·果蝇S2细胞对Blasticidin抗性分析 | 第64页 |
| ·脂质体转染果蝇S2细胞 | 第64-65页 |
| ·果蝇S2细胞的准备 | 第64-65页 |
| ·脂质体DNA的准备 | 第65页 |
| ·细胞的转染 | 第65页 |
| ·抗性细胞的筛选 | 第65页 |
| ·抗性细胞的诱导表达 | 第65-66页 |
| ·细胞表达上清的鉴定 | 第66页 |
| ·细胞表达产物的鉴定 | 第66-68页 |
| ·样品收集 | 第66页 |
| ·样品的浓缩处理 | 第66-67页 |
| ·SDS-PAGE和Western Blotting检测 | 第67-68页 |
| 3 结果 | 第68-72页 |
| ·E DomainⅢ基因的PCR扩增 | 第68-69页 |
| ·E DomainⅢ氨基酸全序列及空间结构预测 | 第69-70页 |
| ·pMT/DⅢ重组子的菌落PCR鉴定 | 第70页 |
| ·pMT/DⅢ重组质粒的酶切鉴定 | 第70页 |
| ·细胞表达上清SDS-PAGE检测结果 | 第70-71页 |
| ·细胞表达上清Western Blotting检测结果 | 第71-72页 |
| ·抗性细胞基因组DNA的PCR检测结果 | 第72页 |
| 4 讨论 | 第72-75页 |
| ·E DomainⅢ蛋白功能与特点分析 | 第72-73页 |
| ·EDS表达系统特点介绍 | 第73-74页 |
| ·基于DES表达的E DomainⅢ蛋白及应用情况分析 | 第74-75页 |
| 5 结论 | 第75-76页 |
| 第五部分 WNV抗体检测体系的初步建立与评价 | 第76-90页 |
| 1 研究目的与意义 | 第77页 |
| 2 材料与方法 | 第77-82页 |
| ·材料 | 第77-78页 |
| ·WNV病毒株和培养用细胞株 | 第77页 |
| ·重组WNV E DomainⅢ | 第77页 |
| ·主要用品及仪器 | 第77页 |
| ·主要试剂及溶液配制 | 第77-78页 |
| ·表达的WNV E DomainⅢ蛋白表达量的测定 | 第78页 |
| ·免疫抗原的制备 | 第78-79页 |
| ·阴性与阳性抗WNV血清的制备 | 第79-80页 |
| ·阳性抗WNV血清的纯化 | 第80页 |
| ·间接ELISA法确定E DomainⅢ的特异性 | 第80页 |
| ·制备的WNV E DomainⅢ抗血清与WNV其它同源病毒反应性的检测 | 第80页 |
| ·抗原最佳包被浓度与对照血清最佳稀释度的确定 | 第80-81页 |
| ·封闭试剂与封闭条件的选择 | 第81页 |
| ·酶标抗体工作浓度的确定 | 第81页 |
| ·Cutoff值的确定 | 第81页 |
| ·检测体系特异性的评价 | 第81-82页 |
| ·批内、批间重复性的评价 | 第82页 |
| 3 结果 | 第82-87页 |
| ·表达的WNV E DomainⅢ蛋白表达量检测结果 | 第82-83页 |
| ·抗WNV血清与E DomainⅢ蛋白反应的特异性 | 第83页 |
| ·WNV DomainⅢ蛋白抗血清纯化结果 | 第83-84页 |
| ·WNV DomainⅢ蛋白ELISA使用浓度检测结果 | 第84页 |
| ·检测体系封闭试剂与封闭条件的确定 | 第84-85页 |
| ·封闭时间确定结果 | 第85页 |
| ·酶标抗体工作浓度检测结果 | 第85-86页 |
| ·Cutoff值的确定结果 | 第86页 |
| ·体系特异性的检测结果 | 第86-87页 |
| ·批内、批间重复性的检测结果 | 第87页 |
| 4 讨论 | 第87-89页 |
| ·西尼罗病毒抗体检测体系的特点与应用领域 | 第87-88页 |
| ·建立的抗体检测体系的优缺点分析与评价 | 第88-89页 |
| 5 结论 | 第89-90页 |
| 参考文献 | 第90-104页 |
| 致谢 | 第104-106页 |
| 附录 | 第106-113页 |
| 作者简历 | 第113-114页 |
