| 中文摘要 | 第1-9页 |
| 英文摘要 | 第9-11页 |
| 第一章 前言 | 第11-16页 |
| ·巴斯德毕赤酵母表达系统概况 | 第11-13页 |
| ·Yapsin 蛋白酶家族概况 | 第13-16页 |
| 第二章 实验材料 | 第16-20页 |
| ·材料 | 第16-17页 |
| ·菌株 | 第16页 |
| ·质粒 | 第16页 |
| ·蛋白标准品 | 第16页 |
| ·限制性内切酶及工具酶 | 第16页 |
| ·试剂盒 | 第16页 |
| ·核酸及蛋白分子量标准 | 第16页 |
| ·主要仪器 | 第16-17页 |
| ·试剂 | 第17-20页 |
| ·主要试剂 | 第17页 |
| ·主要培养基 | 第17-18页 |
| ·主要溶液 | 第18-19页 |
| ·特异性核苷酸引物设计 | 第19-20页 |
| 第三章 实验步骤 | 第20-35页 |
| ·Pichia pastoris YP52 全序列的确定 | 第20-27页 |
| ·CODEHOP PCR 扩增YP52 编码序列部分片段 | 第20-22页 |
| ·反向PCR 确定YP52 中间序列两端的未知序列 | 第22-23页 |
| ·TAIL-PCR 确定YP52 下游未知序列 | 第23-25页 |
| ·PpYP52 全序列的克隆 | 第25-27页 |
| ·毕赤酵母YP52 缺陷菌株的构建 | 第27-33页 |
| ·打靶重组质粒pYP52△的构建 | 第27-31页 |
| ·打靶载体pYP52△转化巴斯德毕赤酵母菌G5115 | 第31-33页 |
| ·毕赤酵母YP52 缺陷菌株的评价 | 第33-35页 |
| ·YP52 缺失前后对毕赤酵母表达外源蛋白降解的影响 | 第33-34页 |
| ·从YP52 缺失前后菌株中抽提的不可溶蛋白对HSA 的降解作用 | 第34-35页 |
| 第四章 实验结果 | 第35-45页 |
| ·Pichia pastoris YP52 全序列的确定 | 第35-40页 |
| ·CODEHOP PCR 扩增PpYP52 编码序列部分片段 | 第35页 |
| ·反向 PCR 确定 YPS2 部分编码序列及启动子序列 | 第35-36页 |
| ·TAIL-PCR 确定YP52 下游未知序列 | 第36页 |
| ·PpYP52 全序列的确定 | 第36-40页 |
| ·毕赤酵母YP52 缺陷菌株的构建 | 第40-42页 |
| ·打靶重组质粒的构建 | 第40-41页 |
| ·毕赤酵母YP52 缺陷菌株的构建 | 第41-42页 |
| ·YP52 缺陷菌株的表达评价 | 第42-45页 |
| ·YP52 缺失前后对毕赤酵母表达外源蛋白降解的影响 | 第42-43页 |
| ·对HSA-IFN-α26 降解的影响 | 第42页 |
| ·对HSA-AX15 降解的影响 | 第42-43页 |
| ·比较YP52 缺失前后菌株对HSA 降解的影响 | 第43-45页 |
| 第五章 讨论 | 第45-52页 |
| ·联合利用多种PCR 方法克隆新基因 | 第45-48页 |
| ·CODEHOP PCR 克隆未知基因部分序列 | 第45-46页 |
| ·反向PCR 克隆已知序列侧翼DNA 序列 | 第46页 |
| ·TAIL-PCR 克隆已知序列侧翼DNA 序列 | 第46-48页 |
| ·YP52 序列的分析 | 第48页 |
| ·YP52 同源重组失活方法的探讨 | 第48-49页 |
| ·毕赤酵母重组质粒同源臂长度对重组效率的影响 | 第49-50页 |
| ·巴斯德毕赤酵母对表达产物的降解及解决方法 | 第50-52页 |
| 结论 | 第52-53页 |
| 参考文献 | 第53-57页 |
| 发表文章 | 第57-70页 |
| 个人简历 | 第70-71页 |
| 致谢 | 第71页 |
