| 中文摘要 | 第1-11页 |
| 英文摘要 | 第11-13页 |
| 1 前言 | 第13-32页 |
| ·蛋白激酶概述 | 第13-17页 |
| ·蛋白激酶在细胞信号转导中的作用和意义 | 第13-14页 |
| ·蛋白激酶的分类研究 | 第14-15页 |
| ·蛋白激酶的共同特征 | 第15-16页 |
| ·蛋白激酶一级结构的特征 | 第16-17页 |
| ·蛋白激酶的生化特征 | 第17页 |
| ·蛋白激酶的调控机制 | 第17-18页 |
| ·蛋白激酶对靶底物的调控方式 | 第17-18页 |
| ·蛋白激酶活性的激活和抑制 | 第18页 |
| ·真菌蛋白激酶的研究现状 | 第18-30页 |
| ·蛋白激酶在真菌信号传导中的作用 | 第18-19页 |
| ·丝状真菌蛋白激酶的种类及研究现状 | 第19-30页 |
| ·本研究的立题依据、研究内容及技术路线 | 第30-32页 |
| ·立题依据 | 第30页 |
| ·研究内容 | 第30-31页 |
| ·技术路线 | 第31-32页 |
| 2 材料与方法 | 第32-54页 |
| ·材料 | 第32-35页 |
| ·供试菌株 | 第32页 |
| ·质粒 | 第32页 |
| ·酶和生化试剂 | 第32页 |
| ·仪器 | 第32-33页 |
| ·溶液配制 | 第33-34页 |
| ·培养基配制 | 第34-35页 |
| ·嗜热真菌蛋白激酶CDNA 的克隆和序列分析 | 第35-42页 |
| ·引物设计 | 第35页 |
| ·疏绵状嗜热丝孢菌总RNA 的提取 | 第35-36页 |
| ·RNA 中DNA 的消化 | 第36页 |
| ·紫外检测RNA 产率和纯度 | 第36页 |
| ·反转录cDNA 第一链的合成 | 第36-37页 |
| ·菌丝体DNA 的抽提 | 第37-38页 |
| ·目的基因全长cDNA 的克隆 | 第38-42页 |
| ·丝/苏氨酸蛋白激酶(Ser/Thr-PK)基因全长序列的生物信息学分析 | 第42页 |
| ·嗜热真菌蛋白激酶基因在毕赤酵母中的表达 | 第42-50页 |
| ·蛋白激酶基因成熟肽序列的分离 | 第42-43页 |
| ·酵母表达载体的构建 | 第43-44页 |
| ·线性化质粒DNA 的制备 | 第44页 |
| ·酵母转化 | 第44-46页 |
| ·酵母转化子的筛选与鉴定 | 第46-48页 |
| ·外源基因多拷贝整合转化子筛选 | 第48-49页 |
| ·工程菌的培养和丝/苏氨酸蛋白激酶的诱导分泌表达 | 第49页 |
| ·pPIC3.5K/pk 酵母工程菌 PS-PK-18 的细胞破壁 | 第49-50页 |
| ·酵母工程菌 PS-PK-16 和 PS-PK-18 表达产物的 SDS-PAGE 分析 | 第50页 |
| ·目的蛋白的回收 | 第50页 |
| ·嗜热真菌 Thermomyces lanuginosus 蛋白激酶基因在毕赤酵母及原始菌 株中的表达量差异分析 | 第50-52页 |
| ·酵母工程菌总RNA 的提取 | 第50-51页 |
| ·Thermomyces lanuginosus 连续七天总 RNA 的提取 | 第51页 |
| ·RNA 中DNA 的消化 | 第51页 |
| ·紫外检测RNA 产率和纯度 | 第51页 |
| ·反转录cDNA 第一链的合成 | 第51页 |
| ·RT-PCR 检测 | 第51页 |
| ·荧光定量PCR 的反应体系 | 第51-52页 |
| ·荧光定量PCR 的反应程序 | 第52页 |
| ·打靶载体 pUCATPB/PK 的构建 | 第52-54页 |
| ·引物设计 | 第52页 |
| ·片段的扩增 | 第52页 |
| ·质粒提取 | 第52页 |
| ·双酶切反应 | 第52-53页 |
| ·酶切产物的纯化 | 第53页 |
| ·酶切产物的链接 | 第53页 |
| ·重组质粒的鉴定 | 第53-54页 |
| 3 结果与分析 | 第54-87页 |
| ·嗜热真菌蛋白激酶CDNA 的克隆和序列分析 | 第54-63页 |
| ·疏绵状嗜热丝孢菌总RNA 的提取 | 第54页 |
| ·疏绵状嗜热丝孢菌DNA 的分离 | 第54-55页 |
| ·疏绵状嗜热丝孢菌蛋白激酶基因全长cDNA 的分离 | 第55-56页 |
| ·疏绵状嗜热丝孢菌蛋白激酶基因的核苷酸和氨基酸序列分析 | 第56-63页 |
| ·疏绵状嗜热丝孢菌蛋白激酶基因在毕赤酵母中的表达 | 第63-72页 |
| ·蛋白激酶基因成熟肽基因序列的限制性酶切位点分析 | 第63-64页 |
| ·蛋白激酶成熟肽基因序列的分离 | 第64页 |
| ·酵母表达载体的构建和鉴定 | 第64-66页 |
| ·重组酵母表达质粒pPIC9K/pk 和pPIC3.5K/pk 的酵母转化 | 第66页 |
| ·酵母转化子的甲醇利用表型的筛选 | 第66-67页 |
| ·酵母转化子的PCR 鉴定 | 第67-68页 |
| ·蛋白激酶基因多拷贝整合子的筛选 | 第68页 |
| ·蛋白激酶基因在毕赤酵母中的表达及表达产物的检测 | 第68-72页 |
| ·荧光定量PCR 对蛋白激酶基因表达差异的分析 | 第72-80页 |
| ·RNA 的提取 | 第72-73页 |
| ·RT-PCR 分析 | 第73-75页 |
| ·引物的设计 | 第75页 |
| ·PCR 对基因的检测 | 第75-76页 |
| ·标准曲线的建立 | 第76-77页 |
| ·Ct 值法对表达差异的分析 | 第77-80页 |
| ·打靶载体的构建 | 第80-87页 |
| ·酶切位点分析 | 第80-81页 |
| ·引物设计 | 第81-82页 |
| ·SPK 和XPK 的分离 | 第82-83页 |
| ·打靶载体pUCATPB/PK 的构建 | 第83页 |
| ·打靶载体pUCATPB/PK 的验证 | 第83-87页 |
| 4 讨论 | 第87-95页 |
| ·嗜热真菌 Thermomyces lanuginosus 蛋白激酶 cDNA 的克隆 | 第87-88页 |
| ·RNA 的提取 | 第87页 |
| ·关于引物设计 | 第87-88页 |
| ·疏绵状嗜热丝孢菌 th-ps1 基因在毕赤酵母中的表达 | 第88-90页 |
| ·表达系统比较 | 第88-89页 |
| ·表达载体构建 | 第89页 |
| ·表达产物的分析 | 第89-90页 |
| ·荧光定量PCR 对蛋白激酶基因表达差异的分析 | 第90-93页 |
| ·酵母RNA 提取的难点 | 第90-91页 |
| ·不同破胞方法与RNA 的完整性 | 第91页 |
| ·DNA 污染的去除 | 第91页 |
| ·内参基因的选择 | 第91-92页 |
| ·实时荧光定量PCR 方法的选择 | 第92页 |
| ·引物设计 | 第92-93页 |
| ·模板质量与浓度 | 第93页 |
| ·循环数 | 第93页 |
| ·重复实验和阴性、阳性对照实验 | 第93页 |
| ·打靶载体的构建 | 第93-95页 |
| 5 结论 | 第95-96页 |
| 参考文献 | 第96-104页 |
| 致谢 | 第104页 |
