| 中文摘要 | 第1-8页 |
| 英文摘要 | 第8-11页 |
| 前言 | 第11-27页 |
| 一、基因表达调控网络与隔离子／边界元件的多种作用机制和模型 | 第11-17页 |
| 二、人β-珠蛋白基因簇上的隔离(屏障)机制 | 第17-23页 |
| 三、Cre重组酶介导的盒交换技术的特点 | 第23-26页 |
| 四、本研究的主要内容 | 第26-27页 |
| 材料与方法 | 第27-39页 |
| 一、实验材料 | 第27-28页 |
| 1.菌株与质粒 | 第27页 |
| 2.细胞系 | 第27页 |
| 3.限制性内切酶与修饰酶 | 第27页 |
| 4.试剂盒 | 第27页 |
| 5.其它主要试剂 | 第27页 |
| 6.放射性核素 | 第27页 |
| 7.主要仪器设备 | 第27-28页 |
| 二、实验方法 | 第28-39页 |
| 1.基本技术路线 | 第28-29页 |
| 2.Cre重组酶介导的盒交换载体的设计与构建 | 第29-32页 |
| ·从琼脂糖凝胶中回收DNA片段 | 第29页 |
| ·DNA片段3’端凹陷的补平 | 第29页 |
| ·载体的去磷酸化 | 第29页 |
| ·连接反应 | 第29-30页 |
| ·CaCl_2感受态大肠杆菌细胞的制备 | 第30页 |
| ·电转感受态大肠杆菌细胞的制备 | 第30页 |
| ·感受态细胞的转化 | 第30页 |
| ·感受态细胞的快速转化 | 第30页 |
| ·质粒DNA的小量制备 | 第30-31页 |
| ·质粒DNA的中量制备 | 第31页 |
| ·PCR引物及反应条件 | 第31-32页 |
| 3.电穿孔转染MEL细胞和Hygromycin~R单克隆细胞株的筛选 | 第32-33页 |
| ·细胞复苏 | 第32页 |
| ·细胞培养和细胞传代 | 第32页 |
| ·细胞冻存 | 第32页 |
| ·MEL细胞的Hygromycin毒性实验 | 第32页 |
| ·％甲基纤维素储存液的制备 | 第32页 |
| ·电穿孔转染MEL细胞 | 第32-33页 |
| ·Hygromycin~R单克隆细胞株的挑取及扩增 | 第33页 |
| 4.Hygromycin~R单克隆细胞株的基因组结构分析 | 第33-35页 |
| ·细胞基因组DNA的提取 | 第33页 |
| ·利用PCR和Southern杂交鉴定Hygromycin~R单克隆细胞株 | 第33-35页 |
| 5.Cre重组酶介导的盒交换 | 第35页 |
| ·Hygromycin~R单克隆细胞株的培养 | 第35页 |
| ·Gancyclovir溶液配制以及毒性实验 | 第35页 |
| ·交换载体与Cre表达载体共转染Hygromycin~R单克隆细胞株 | 第35页 |
| ·Gancyclovir~R单克隆细胞株的挑取及扩增 | 第35页 |
| 6.Gancyclovir~R单克隆细胞株的基因组结构和报告基因表达分析 | 第35-36页 |
| ·细胞基因组DNA的提取 | 第35页 |
| ·利用PCR鉴定Gancyclovir~R单克隆细胞株 | 第35-36页 |
| ·DMSO诱导Gancyclovir~R单克隆细胞分化 | 第36页 |
| ·流式细胞仪分析Gancyclovir~R单克隆细胞株EGFP基因的表达 | 第36页 |
| 7.表达Cre的重组腺病毒介导的盒交换 | 第36-39页 |
| ·表达Cre的重组腺病毒介导的盒交换的基本技术路线 | 第36-37页 |
| ·重组腺病毒载体的设计与构建 | 第37页 |
| ·AdEasy系统介导的重组腺病毒在大肠杆菌中的重组 | 第37页 |
| ·重组腺病毒质粒DNA转染GP293细胞 | 第37-38页 |
| ·表达Cre的重组腺病毒的鉴定 | 第38-39页 |
| 实验结果 | 第39-63页 |
| 一、Cre重组酶介导的盒交换载体的构建与鉴定 | 第39-50页 |
| 1.靶载体pβ-EGFP-Neo的构建 | 第39-41页 |
| 2.含有732 bp HS2核心序列的交换载体的构建 | 第41-42页 |
| 3.含有微小位点控制区(miniLCR)的交换载体的构建 | 第42-47页 |
| 4.含有5'HS5的交换载体的构建 | 第47-50页 |
| 二、靶载体pβ-EGFP-Neo在Hygromycin~R单克隆细胞株中的整合 | 第50-51页 |
| 三、交换载体在Hygromycin~R单克隆细胞株A中的交换 | 第51-59页 |
| 1.Cre重组酶介导的盒交换 | 第51-53页 |
| 2.报告基因在Gancyclovir~R单克隆细胞株中的表达 | 第53-59页 |
| 四、表达Cre的重组腺病毒介导的盒交换 | 第59-63页 |
| 1.重组腺病毒载体的设计与构建 | 第59页 |
| 2.AdEasy介导的重组腺病毒在大肠杆菌中的重组 | 第59-60页 |
| 3.重组腺病毒质粒DNA转染GP293细胞 | 第60-61页 |
| 4.表达Cre的重组腺病毒的鉴定 | 第61-63页 |
| 讨论 | 第63-80页 |
| 一、人β-珠蛋白基因簇5'HS5的增强子阻断作用(enhancer blocker) | 第63-66页 |
| 二、人β-珠蛋白基因簇5'HS5增强子阻断作用(enhancer blocker)的机制 | 第66-70页 |
| 三、人β-珠蛋白基因簇5'HS5的边界元件(boundary element,barrier)作用 | 第70-71页 |
| 四、人β-珠蛋白基因簇远端DNase Ⅰ高敏位点的调控功能及作用模型 | 第71-76页 |
| 五、Cre重组酶介导的盒交换技术的方法学探讨 | 第76-78页 |
| 六、本研究的不足之处及今后工作设想 | 第78-80页 |
| 小结 | 第80-81页 |
| 参考文献 | 第81-93页 |
| 文献综述一 | 第93-103页 |
| 文献综述二 | 第103-117页 |
| 英文名词及缩写 | 第117-118页 |
| 致谢 | 第118-119页 |
| 个人简历 | 第119页 |
