| 中文摘要 | 第1-13页 |
| 英文摘要 | 第13-15页 |
| 1.引言 | 第15-30页 |
| ·抗体药物研究进展 | 第15-17页 |
| ·抗体综述 | 第15-16页 |
| ·抗体药物生产技术研究进展 | 第16-17页 |
| ·抗体纯化技术研究进展 | 第17-21页 |
| ·盐析法 | 第17页 |
| ·Protein A 出现之前应用于抗体提纯的层析技术 | 第17-19页 |
| ·以 Protein A 为代表的亲和层析技术研究进展 | 第19-21页 |
| ·亲和层析配体研究进展 | 第21-28页 |
| ·G 群链球菌蛋白 G(Protein G) | 第21-22页 |
| ·大消化链球菌蛋白 L(Protein L) | 第22-24页 |
| ·金黄色葡萄球菌蛋白 A(Protein A) | 第24-26页 |
| ·蛋白 A 类似物作为配体 | 第26-28页 |
| ·蛋白 C1q 及 MBP 在 IgM 纯化上的应用 | 第28页 |
| ·SUMO 蛋白标签研究进展 | 第28-29页 |
| ·SUMO 分类和结构 | 第28页 |
| ·SUMO 的生物学活性 | 第28-29页 |
| ·SPA 研究的必要性 | 第29页 |
| ·SPA 研究的目的和意义 | 第29-30页 |
| 2.材料 | 第30-33页 |
| ·实验材料 | 第30页 |
| ·克隆和表达载体 | 第30页 |
| ·酶和生化试剂 | 第30页 |
| ·引物 | 第30-31页 |
| ·主要仪器和设备 | 第31-33页 |
| 3.方法 | 第33-52页 |
| ·金黄色葡萄球菌蛋白 A 基因的克隆与序列分析 | 第33-36页 |
| ·金黄色葡萄球菌的培养 | 第33页 |
| ·金黄色葡萄球菌基因组 DNA 的提取 | 第33页 |
| ·SPA 成熟蛋白全长基因的 PCR 扩增 | 第33-34页 |
| ·PCR 产物的回收 | 第34页 |
| ·PCR 回收产物与克隆载体的连接 | 第34页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第34-35页 |
| ·重组克隆载体的转化 | 第35页 |
| ·阳性克隆的筛选 | 第35页 |
| ·阳性重组质粒的鉴定 | 第35-36页 |
| ·成熟 SPA 全长基因序列测定与结果分析 | 第36页 |
| ·pET-30a-SPA 原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中表达 | 第36-38页 |
| ·pET30a(+)表达载体和 SPA 插入片段的制备 | 第36-37页 |
| ·SPA 片段与 pET30a(+)表达载体的连接 | 第37页 |
| ·重组原核表达载体的转化 | 第37页 |
| ·阳性重组质粒的筛选与鉴定 | 第37页 |
| ·阳性重组质粒转化表达宿主菌及鉴定 | 第37-38页 |
| ·pET-30a-SPA 重组质粒的诱导条件的确定 | 第38页 |
| ·pHis-SUMO-SPA 高效原核表达载体的构建极其在大肠杆菌中表达 | 第38-41页 |
| ·pHis-SUMO-SPA 高效原核表达载体的构建 | 第39-41页 |
| ·重组质粒 pHis-SUMO-SPA 在大肠杆菌的表达 | 第41页 |
| ·SPA 功能区蛋白基因高效原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中表达 | 第41-45页 |
| ·用于表达 FSPA 的 pHis-SUMO 表达载体的构建 | 第42-44页 |
| ·pHis-SUMO-FSPA 重组质粒在大肠杆菌中的表达 | 第44页 |
| ·pHis-SUMO-SPA/pHis-SUMO-FSPA 两种重组表达载体表达条件的优化 | 第44-45页 |
| ·SUMO-SPA 和 SUMO-FSPA 两种蛋白表达量分析 | 第45页 |
| ·目的蛋白的纯化 | 第45-46页 |
| ·HisTrapTM FF crude colum 的平衡 | 第45页 |
| ·融合蛋白 SUMO-SPA 和 SUMO-FSPA 的纯化 | 第45-46页 |
| ·融合蛋白 SUMO-SPA 和 SUMO-FSPA 脱盐 | 第46页 |
| ·纯化后的 SUMO-SPA 和 SUMO-FSPA 两种蛋白的质量分析 | 第46页 |
| ·Ni SepharoseTM 6 Fast Flow 的再生与保存 | 第46页 |
| ·融合蛋白 SUMO-SPA、SUMO-FSPA 抗体结合活性的的测定 | 第46-47页 |
| ·融合蛋白 SUMO-FSPA 稳定性的测定 | 第47-48页 |
| ·融合蛋白 SUMO-FSPA 与固相载体的连接 | 第48-50页 |
| ·环氧氯丙烷活化的琼脂糖方法 | 第48-49页 |
| ·羰基二咪唑活化的琼脂糖 | 第49页 |
| ·溴化氰活化的琼脂糖 | 第49-50页 |
| ·SUMO-FSPA-agarose 在纯化抗体方面的应用 | 第50-52页 |
| ·抗 mFGF21 的兔免疫血清的制备 | 第50-51页 |
| ·利用 SUMO-FSPA-agarose 对免疫后的兔血清进行抗体纯化 | 第51页 |
| ·对纯化后的抗体进行浓度纯度及效价的检测 | 第51-52页 |
| 4.实验结果 | 第52-76页 |
| ·金黄色葡萄球菌蛋白 A(SPA)全长基因的克隆 | 第52-55页 |
| ·金黄色葡萄球菌基因组 DNA 的提取 | 第52页 |
| ·SPA 全长基因的 PCR 扩增 | 第52-53页 |
| ·PCR 产物的回收 | 第53页 |
| ·重组克隆质粒 pMD18-T-SPA 的鉴定 | 第53页 |
| ·SPA 全长基因序列测定与结果分析 | 第53-55页 |
| ·pET-30a-SPA 原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中表达 | 第55-58页 |
| ·pET30a 表达载体和 SPA 基因插入片段的制备 | 第55页 |
| ·阳性重组质粒 pET-30a-SPA 的筛选与鉴定 | 第55-56页 |
| ·pET-30a-SPA 重组质粒的诱导条件的确定 | 第56-58页 |
| ·pHis-SUMO-SPA 高效原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中表达 | 第58-61页 |
| ·pHis-SUMO-SPA 重组表达载体的构建 | 第58-60页 |
| ·pHis-SUMO-SPA 重组质粒的诱导 | 第60-61页 |
| ·pHis-SUMO-FSPA 高效原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中表达 | 第61-64页 |
| ·pHis-SUMO-FSPA 高效原核表达载体的构建 | 第61-63页 |
| ·pHis-SUMO-FSPA 重组质粒的诱导 | 第63-64页 |
| ·融合蛋白 SUMO-SPA 和 SUMO-FSPA 表达条件的优化与表达量分析 | 第64-70页 |
| ·SUMO-SPA 表达条件的优化 | 第64-66页 |
| ·融合蛋白 SUMO-SPA 表达量的分析 | 第66-67页 |
| ·SUMO-FSPA 表达条件的优化 | 第67-69页 |
| ·重组 pHis-SUMO-FSPA 融合蛋白表达量分析 | 第69-70页 |
| ·目的蛋白的纯化 | 第70-71页 |
| ·SUMO-SPA 蛋白和 SUMO-FSPA 蛋白的纯化 | 第70-71页 |
| ·SUMO-SPA 和 SUMO-FSPA 两种蛋白抗体结合活性的检测 | 第71-72页 |
| ·融合蛋白 SUMO-FSPA 稳定性实验 | 第72页 |
| ·目的蛋白 SUMO-FSPA 与活化琼脂糖的偶联 | 第72-74页 |
| ·环氧氯丙烷活化的琼脂糖 | 第73页 |
| ·羰基二咪唑活化的琼脂糖 | 第73页 |
| ·溴化氰活化的琼脂糖偶联 | 第73-74页 |
| ·抗体的纯化和检测 | 第74-76页 |
| ·抗体的纯化效果 | 第74-75页 |
| ·抗体效价的测定 | 第75-76页 |
| 5.讨论 | 第76-83页 |
| ·金黄色葡萄球菌菌株的选择及蛋白 A 的基因多态性 | 第76页 |
| ·菌株的选择 | 第76页 |
| ·蛋白 A 基因的多态性 | 第76页 |
| ·表达载体的选择和表达条件的确定 | 第76-77页 |
| ·表达载体的选择 | 第76-77页 |
| ·表达载体的构建 | 第77页 |
| ·目的蛋白的纯化 | 第77-78页 |
| ·目的蛋白抗体结合活性与稳定性的检测 | 第78-79页 |
| ·抗体结合活性的检测 | 第78页 |
| ·SUMO-FSPA 蛋白稳定性检测 | 第78-79页 |
| ·偶联反应介质的选择和条件的摸索 | 第79-80页 |
| ·兔血清抗体的纯化 | 第80-81页 |
| ·高免兔血清的制备 | 第80页 |
| ·抗体纯化方法 | 第80-81页 |
| ·抗体的效价 | 第81页 |
| ·融合蛋白 SUMO-FSPA 的应用前景 | 第81-83页 |
| 6 结论 | 第83-84页 |
| 致谢 | 第84-85页 |
| 参考文献 | 第85-91页 |
| 附录A | 第91-92页 |
| 附录B | 第92-93页 |
| 附录C | 第93-94页 |
| 附录D | 第94-95页 |
| 附录E | 第95-97页 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 | 第97页 |
