| 摘要 | 第1-11页 |
| Abstract | 第11-13页 |
| 1 引言 | 第13-22页 |
| ·聚酮类抗生素简介 | 第13-14页 |
| ·聚酮类抗生素概念 | 第13页 |
| ·聚酮类抗生素分类 | 第13-14页 |
| ·米尔贝霉素简介 | 第14-17页 |
| ·链霉菌概述 | 第17-18页 |
| ·链霉菌简介 | 第17页 |
| ·冰城链霉菌简介 | 第17-18页 |
| ·微生物转化概述 | 第18-19页 |
| ·SAM-依赖的甲基转移酶概述 | 第19-20页 |
| ·甲基转移酶简介 | 第19页 |
| ·大环内酯类抗生素产生菌氧甲基转移酶简介 | 第19-20页 |
| ·研究目的和内容 | 第20-22页 |
| ·研究的目的和意义 | 第20页 |
| ·课题来源和研究内容 | 第20-22页 |
| 2 实验材料和仪器 | 第22-26页 |
| ·菌种 | 第22页 |
| ·质粒 | 第22页 |
| ·主要化学试剂 | 第22-23页 |
| ·基因克隆试剂 | 第22页 |
| ·C5-O-甲基转移酶表达试剂 | 第22页 |
| ·酶功能验证及高效液相色谱分析试剂 | 第22-23页 |
| ·培养基及溶液 | 第23-25页 |
| ·培养基 | 第23页 |
| ·溶液 | 第23-25页 |
| ·主要仪器 | 第25-26页 |
| 3 实验方法 | 第26-41页 |
| ·C 5-O-甲基转移酶基因克隆及序列分析 | 第26-33页 |
| ·冰城链霉菌(Streptomyces bingchenggensis)菌丝体制备 | 第26页 |
| ·冰城链霉菌总DNA 的提取 | 第26-27页 |
| ·冰城链霉菌C5-O-甲基转移酶基因(binD)部分序列的扩增 | 第27-29页 |
| ·冰城链霉菌C5-O-甲基转移酶基因(binD)全序列的扩增 | 第29-30页 |
| ·PCR 扩增产物的凝胶电泳 | 第30页 |
| ·PCR 产物的纯化 | 第30页 |
| ·目的片段与克隆载体的连接 | 第30-31页 |
| ·E.coli DH5α感受态细胞的制备 | 第31-32页 |
| ·连接产物的转化 | 第32页 |
| ·重组质粒的鉴定与测序 | 第32-33页 |
| ·冰城链霉菌C5-O-甲基转移酶基因在大肠杆菌中的表达 | 第33-37页 |
| ·冰城链霉菌C5-O-甲基转移酶基因的扩增 | 第33-34页 |
| ·PCR 产物和表达载体的酶切及回收 | 第34页 |
| ·目的片段与表达载体的连接 | 第34-35页 |
| ·重组质粒在克隆宿主中的鉴定 | 第35-36页 |
| ·重组质粒转化到表达宿主菌 | 第36页 |
| ·重组质粒在表达宿主中的鉴定 | 第36页 |
| ·重组质粒pET-30a-binD 在大肠杆菌中的诱导表达 | 第36页 |
| ·表达产物的检测SDS-PAGE 电泳 | 第36-37页 |
| ·表达蛋白BinD 的纯化 | 第37-39页 |
| ·镍琼脂糖凝胶柱的准备 | 第37-38页 |
| ·样品的纯化 | 第38页 |
| ·包涵体复性 | 第38-39页 |
| ·表达蛋白功能鉴定 | 第39-40页 |
| ·大肠杆菌生物转化 | 第39页 |
| ·体外酶活反应 | 第39-40页 |
| ·酶反应最适pH 和温度的测定 | 第40-41页 |
| 4 结果与分析 | 第41-57页 |
| ·C5-O-甲基转移酶基因的克隆及序列分析 | 第41-46页 |
| ·冰城链霉菌总DNA 的提取检测 | 第41页 |
| ·冰城链霉菌 C5-O-甲基转移酶基因部分序列扩增及分析 | 第41-43页 |
| ·冰城链霉菌C5-O-甲基转移酶基因(binD)全序列的扩增 | 第43-45页 |
| ·冰城链霉菌C5-O-甲基转移酶蛋白分析 | 第45-46页 |
| ·冰城链霉菌C5-O-甲基转移酶基因的原核表达载体构建 | 第46-49页 |
| ·表达载体构建所需的C5-O-甲基转移酶基因的获取 | 第46-47页 |
| ·pET-30a 和目标 DNA 的双酶切及回收 | 第47页 |
| ·原核表达的重组质粒鉴定 | 第47-49页 |
| ·含重组质粒的 E.coli BL21 对 milbemycinA3 和 A4 生物转化 | 第49-51页 |
| ·C5-O-甲基转移酶蛋白的表达纯化 | 第51-53页 |
| ·C5-O-甲基转移酶蛋白的 SDS-PAGE 检测 | 第51-52页 |
| ·低温诱导不同诱导剂浓度对表达的影响 | 第52-53页 |
| ·包含体变性纯化SDS-PAGE 检测及复性 | 第53页 |
| ·分离纯化的BinD 体外功能鉴定 | 第53-55页 |
| ·温度和pH 对酶的活性影响 | 第55-57页 |
| 5 讨论 | 第57-60页 |
| ·冰城链霉菌C5-O-甲基转移酶基因的克隆 | 第57页 |
| ·C5-O-甲基转移酶的原核表达 | 第57-58页 |
| ·包涵体的形成 | 第58页 |
| ·大肠杆菌生物转化 | 第58-59页 |
| ·体外生物活性的测定 | 第59页 |
| ·pH 和温度对酶活的影响 | 第59-60页 |
| 6 结论 | 第60-61页 |
| 致谢 | 第61-62页 |
| 参考文献 | 第62-66页 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 | 第66页 |
