| 摘要 | 第1-6页 |
| ABSTRACT | 第6-12页 |
| 英文缩写词 | 第12-14页 |
| 第一章 文献综述 | 第14-26页 |
| ·国内外研究进展 | 第14-16页 |
| ·胸苷酸合成酶简介 | 第16-19页 |
| ·胸苷酸合成酶的催化机制 | 第16-17页 |
| ·胸苷酸合成酶基因调控机制的研究 | 第17-19页 |
| ·大肠杆菌表达系统、表达载体的简介 | 第19-20页 |
| ·大肠杆菌载体的基本要求 | 第19页 |
| ·常见大肠杆菌载体的分类 | 第19-20页 |
| ·重组菌株的优化表达 | 第20-21页 |
| ·影响目的基因表达的重要因素 | 第20-21页 |
| ·重组菌株最优表达条件的确立 | 第21页 |
| ·蛋白质复性策略 | 第21-24页 |
| ·蛋白质复性机制 | 第21-22页 |
| ·蛋白质复性方法 | 第22-23页 |
| ·影响复性效率的因素 | 第23-24页 |
| ·复性过程注意问题 | 第24页 |
| ·复性效率检测 | 第24页 |
| ·本课题研究目的及意义 | 第24-26页 |
| 第二章 重组人类胸苷酸合成酶大肠杆菌表达载体 TS-pET-28b(+)的构建 | 第26-43页 |
| 前言 | 第26-27页 |
| ·实验材料 | 第27-29页 |
| ·主要实验仪器 | 第27页 |
| ·主要实验材料 | 第27-28页 |
| ·常用试剂、缓冲液、培养基的配制方法 | 第28-29页 |
| ·实验方法 | 第29-35页 |
| ·碱法提取大肠杆菌质粒 | 第29-30页 |
| ·引物设计 | 第30页 |
| ·PCR 扩增目的基因 | 第30页 |
| ·NDA 样品的琼脂糖凝胶电泳检测 | 第30-31页 |
| ·胶回收试剂盒纯化DNA样品 | 第31页 |
| ·T/A 克隆 | 第31-32页 |
| ·限制性内酶反应 | 第32页 |
| ·连接反应 | 第32页 |
| ·CaCl_2法制备大肠杆菌感受态细胞 | 第32-33页 |
| ·转化感受态细胞 | 第33页 |
| ·阳性转化子的筛选 | 第33-35页 |
| ·实验结果及讨论 | 第35-42页 |
| ·重组表达质粒TS-pET-28b(+)构建策略 | 第35-37页 |
| ·人TS cDNA PCR 扩增引物的设计 | 第37页 |
| ·TS cDNA 的PCR 扩增 | 第37页 |
| ·PCR 产物与克隆载体pMD18-T 连接及阳性亚克隆子的筛选和鉴定 | 第37-39页 |
| ·重组质粒TS-pMD18-T和表达质粒pET-28b(+)的双酶切 | 第39-40页 |
| ·目的基因TS 与表达载体pET-28b(+)的连接及阳性克隆的鉴定筛选 | 第40-42页 |
| ·实验小结 | 第42-43页 |
| 第三章 重组人 TS 蛋白的高效表达及纯化 | 第43-72页 |
| 前言 | 第43-44页 |
| ·实验材料 | 第44-47页 |
| ·主要实验仪器 | 第44页 |
| ·实验菌种及质粒 | 第44-45页 |
| ·主要试剂及配制 | 第45-47页 |
| ·实验方法 | 第47-54页 |
| ·选择性培养基筛选具有Amp(或Kan)抗生素阳性菌种 | 第47页 |
| ·大肠杆菌生长曲线的测定 | 第47-48页 |
| ·大肠杆菌的诱导表达 | 第48页 |
| ·SDS-PAGE 上样量的确定 | 第48页 |
| ·SDS-PAGE 检测蛋白质分子大小 | 第48-49页 |
| ·Western Blot 检测hTS 的表达 | 第49-50页 |
| ·Bradford 法测蛋白质浓度 | 第50页 |
| ·重组蛋白表达形式分析 | 第50-51页 |
| ·单因素实验 | 第51-52页 |
| ·正交试验确定最优表达条件 | 第52页 |
| ·亲和色谱层析分离蛋白质 | 第52-54页 |
| ·实验结果与分析 | 第54-69页 |
| ·重组人TS 蛋白的高效表达及纯化的实验策略 | 第54-55页 |
| ·大肠杆菌生长曲线测定 | 第55-56页 |
| ·hTS 的诱导表达 | 第56-57页 |
| ·原核表达产物的Western Blot 检测 | 第57-58页 |
| ·重组人TS 表达形式的定位 | 第58页 |
| ·单因素实验 | 第58-65页 |
| ·温度单因素实验 | 第58-60页 |
| ·IPTG浓度单因素实验 | 第60-63页 |
| ·诱导时间单因素实验 | 第63-65页 |
| ·正交试验优化表达条件 | 第65-67页 |
| ·亲和色谱分离纯化重组人TS | 第67-69页 |
| ·最佳咪唑浓度的确定 | 第68页 |
| ·亲和色谱分离目的蛋白 | 第68-69页 |
| ·实验小结 | 第69-72页 |
| 第四章 胸苷酸合成酶辅因子m THF 的合成 | 第72-80页 |
| 前言 | 第72页 |
| ·实验材料 | 第72-73页 |
| ·实验仪器 | 第72-73页 |
| ·实验试剂 | 第73页 |
| ·实验方法 | 第73-76页 |
| ·四氢叶酸的合成 | 第73-74页 |
| ·四氢叶酸的鉴定及含量测 | 第74-75页 |
| ·5, 10-亚甲基四氢叶酸的合成 | 第75-76页 |
| ·实验结果 | 第76-78页 |
| ·四氢叶酸的合成以及条件优化 | 第76-77页 |
| ·正交试验 | 第76页 |
| ·正交试验结果分析 | 第76-77页 |
| ·5, 10-亚甲基四氢叶酸的合成、鉴别及纯化 | 第77-78页 |
| ·实验小结 | 第78-80页 |
| 第五章 重组人TS蛋白的体外复性及其生物活性分析 | 第80-88页 |
| 前言 | 第80页 |
| ·实验材料 | 第80-82页 |
| ·实验仪器 | 第80-81页 |
| ·实验试剂 | 第81页 |
| ·常用试剂配制 | 第81-82页 |
| ·实验方法 | 第82-83页 |
| ·透析袋预处理 | 第82页 |
| ·待复性蛋白的预处理 | 第82页 |
| ·变性蛋白的透析复性 | 第82页 |
| ·蛋白复性得率的测定 | 第82-83页 |
| ·重组人TS 酶活力及比活力的测定 | 第83页 |
| ·人类TS抑制剂IC_(50)的测定步骤 | 第83页 |
| ·实验结果 | 第83-87页 |
| ·复性前后蛋白质的SDS-PAGE 电泳分析 | 第83-84页 |
| ·重组人TS 复性得率的测定 | 第84-85页 |
| ·重组人TS 酶活力U 及比活力sp 的测定 | 第85页 |
| ·商品化人TS 抑制剂：培美曲塞（LY231514）和雷替曲塞（Tomudex）IC_(50)的测定 | 第85-87页 |
| ·实验小结 | 第87-88页 |
| 研究总结 | 第88-90页 |
| 参考文献 | 第90-95页 |
| 附录 | 第95-97页 |
| 致谢 | 第97-98页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文及获奖目录 | 第98-99页 |
