| 摘要 | 第9-10页 |
| Abstract | 第10页 |
| 1 引言 | 第12-20页 |
| 1.1 MC4R基因及研究进展 | 第12-13页 |
| 1.1.1 MC4R基因的功能与调控机理 | 第12页 |
| 1.1.2 MC4R基因与经济性状相关性研究进展 | 第12-13页 |
| 1.2 转基因技术及研究进展 | 第13-14页 |
| 1.2.1 原核显微注射法 | 第13页 |
| 1.2.2 逆转录病毒载体法 | 第13-14页 |
| 1.2.3 精子介导法 | 第14页 |
| 1.2.4 胚胎干细胞法 | 第14页 |
| 1.2.5 体细胞核移植法 | 第14页 |
| 1.3 转染细胞的筛选方法 | 第14-15页 |
| 1.3.1 PCR筛选 | 第14页 |
| 1.3.2 启动子缺失筛选 | 第14-15页 |
| 1.3.3 Poly-A缺失筛选 | 第15页 |
| 1.3.4 正负筛选策略 | 第15页 |
| 1.4 转基因动物的检测 | 第15-16页 |
| 1.5 外源基因拷贝数的检测 | 第16页 |
| 1.5.1 Southern Blot方法 | 第16页 |
| 1.5.2 实时荧光定量PCR方法 | 第16页 |
| 1.6 外源基因整合位点的检测 | 第16-19页 |
| 1.6.1 反向PCR法 | 第17页 |
| 1.6.2 热不对称交错PCR法 | 第17页 |
| 1.6.3 连接介导PCR法 | 第17-19页 |
| 1.7 实验目的与意义 | 第19-20页 |
| 2 材料与方法 | 第20-31页 |
| 2.1 实验材料 | 第20-21页 |
| 2.1.1 实验用的载体 | 第20页 |
| 2.1.2 细胞和菌株 | 第20页 |
| 2.1.3 主要仪器设备 | 第20-21页 |
| 2.1.4 主要药品、试剂 | 第21页 |
| 2.1.5 主要分子生物学软件 | 第21页 |
| 2.2 实验方法 | 第21-26页 |
| 2.2.1 猪MC4R基因的克隆与测序 | 第21-23页 |
| 2.2.2 重组质粒pcDNA3.1(+)-MC4R的构建 | 第23页 |
| 2.2.3 重组质粒pcDNA3.1(+)-MC4R细胞转染及阳性检测 | 第23-26页 |
| 2.3 Real-time PCR方法对外源基因拷贝数的检测 | 第26-27页 |
| 2.3.1 Real-time PCR | 第26-27页 |
| 2.3.2 标准曲线的建立 | 第27页 |
| 2.4 利用LM-PCR检测外源基因的整合位点 | 第27-31页 |
| 2.4.1 接头引物及特异性引物序列设计 | 第27-28页 |
| 2.4.2 基因组的酶切与纯化 | 第28页 |
| 2.4.3 纯化后的基因组DNA连接接头 | 第28-29页 |
| 2.4.4 两轮PCR扩增检测 | 第29-30页 |
| 2.4.5 克隆测序与序列比对 | 第30-31页 |
| 3 结果与分析 | 第31-43页 |
| 3.1 转猪MC4R基因小鼠整合位点检测 | 第31-32页 |
| 3.2 pcDNA3.1(+)-MC4R质粒的构建 | 第32-35页 |
| 3.2.1 民猪的MC4R基因的克隆 | 第32-34页 |
| 3.2.2 pcDNA3.1(+)-MC4R质粒的构建及鉴定 | 第34-35页 |
| 3.3 转染细胞阳性检测 | 第35-36页 |
| 3.3.1 猪PK15细胞的培养及转染效果 | 第35页 |
| 3.3.2 转染细胞的阳性检测 | 第35-36页 |
| 3.4 绝对定量PCR对阳性转染细胞外源基因拷贝数的检测 | 第36-39页 |
| 3.4.1 绝对定量标准曲线 | 第36-38页 |
| 3.4.2 外源基因拷贝数的检测 | 第38-39页 |
| 3.5 外源基因整合位点的检测 | 第39-43页 |
| 3.5.1 细胞基因组的酶切与纯化 | 第39页 |
| 3.5.2 两轮PCR扩增检测 | 第39-40页 |
| 3.5.3 特异性条带克隆测序及比对 | 第40-43页 |
| 4 讨论 | 第43-45页 |
| 4.1 质粒的构建 | 第43页 |
| 4.2 阳性转染细胞的鉴定 | 第43页 |
| 4.3 外源基因拷贝数的检测 | 第43-44页 |
| 4.4 外源基因整合位点的检测 | 第44-45页 |
| 5 结论 | 第45-46页 |
| 致谢 | 第46-47页 |
| 参考文献 | 第47-51页 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 | 第51页 |
