| 摘要 | 第9-11页 |
| Abstract | 第11-12页 |
| 第一章 文献综述 | 第13-24页 |
| 1 猪繁殖与呼吸综合征 | 第13页 |
| 2 猪繁殖与呼吸综合征病毒分子生物学特征 | 第13-16页 |
| 3 猪肺泡巨噬细胞(PAM) | 第16-18页 |
| 4 miRNA功能和研究进展 | 第18-23页 |
| 4.1 miRNA的生物合成过程 | 第18-19页 |
| 4.2 miRNA的作用机制 | 第19页 |
| 4.3 miRNA的研究方法 | 第19-20页 |
| 4.4 miRNA在免疫应答和抗病毒方面的功能研究 | 第20-23页 |
| 4.4.1 miRNA在免疫应答中的作用 | 第20-21页 |
| 4.4.2 miRNA在病毒感染中的作用 | 第21-23页 |
| 5 研究目的和意义 | 第23-24页 |
| 第二章 材料和方法 | 第24-45页 |
| 1 试验材料 | 第24-27页 |
| 1.1 细胞、毒株 | 第24页 |
| 1.2 载体和菌株 | 第24页 |
| 1.3 试验主要仪器和设备 | 第24-25页 |
| 1.4 试验主要药品和试剂 | 第25页 |
| 1.5 试验缓冲液和常用试剂的配制 | 第25-26页 |
| 1.6 主要数据库和软件 | 第26-27页 |
| 2 试验方法 | 第27-45页 |
| 2.1 仔猪的选择及抗体的检测 | 第27-28页 |
| 2.2 PAM的分离及病毒检测 | 第28-30页 |
| 2.2.1 PAM的分离 | 第28-29页 |
| 2.2.2 细胞液RNA的提取 | 第29页 |
| 2.2.3 RNA浓度测定和质量检测 | 第29页 |
| 2.2.4 cDNA的合成 | 第29-30页 |
| 2.2.5 PRRSV抗原检测 | 第30页 |
| 2.3 细胞的培养 | 第30-31页 |
| 2.4 PRRSV的增殖 | 第31-32页 |
| 2.5 PRRSV半数细胞培养物感染量(TCID50)的测定 | 第32页 |
| 2.6 不同猪种PRRSV易感性实验 | 第32-33页 |
| 2.6.1 PAM细胞的收集 | 第32页 |
| 2.6.2 绝对荧光定量PCR绘制不同猪种病毒复制曲线 | 第32-33页 |
| 2.7 高通量测序样品的准备 | 第33-34页 |
| 2.7.1 PAM的培养和处理 | 第33页 |
| 2.7.2 细胞总RNA的提取 | 第33页 |
| 2.7.3 RNA浓度测定和质量检测 | 第33-34页 |
| 2.8 Solexa上样测序、数据的产生及生物信息学数据分析 | 第34页 |
| 2.8.1 生物信息学分析流程 | 第34页 |
| 2.8.2 基本生物信息学分析 | 第34页 |
| 2.8.3 高级生物信息学分析 | 第34页 |
| 2.9 候选miRNAs的验证 | 第34-39页 |
| 2.9.1 总RNA去除基因组污染 | 第34-35页 |
| 2.9.2 茎环引物反转录cDNA第一链的合成 | 第35页 |
| 2.9.3 cDNA检测 | 第35-36页 |
| 2.9.4 miRNAs成熟序列的扩增引物及茎环反转录特异引物的设计 | 第36-37页 |
| 2.9.5 miRNAs成熟序列的扩增 | 第37页 |
| 2.9.6 miRNAs成熟序列的克隆鉴定 | 第37-38页 |
| 2.9.7 实时定量法对miRNAs的验证 | 第38-39页 |
| 2.10 半定量法检测miRNA组织表达谱 | 第39-40页 |
| 2.10.1 大白猪各组织样总RNA的提取 | 第39页 |
| 2.10.2 cDNA的合成 | 第39页 |
| 2.10.3 miRNA组织表达谱分析 | 第39-40页 |
| 2.11 miR-210靶基因验证 | 第40-45页 |
| 2.11.1 靶基因MX13'UTR的扩增 | 第40-41页 |
| 2.11.2 pMD18-T片段质粒的双酶切及缺失片段的回收 | 第41-42页 |
| 2.11.3 pmirGLO载体的构建 | 第42页 |
| 2.11.4 pmirGLO质粒的中量提取 | 第42-43页 |
| 2.11.5 细胞转染 | 第43-44页 |
| 2.11.6 双荧光素酶报告基因的检测 | 第44-45页 |
| 第三章 结果与分析 | 第45-74页 |
| 1 PAM细胞PRRSV检测 | 第45页 |
| 2 不同猪种PRRSV易感性试验 | 第45-47页 |
| 2.2 QORF7重组质粒标准曲线的绘制 | 第46-47页 |
| 2.3 不同品种猪PRRSV动力复制曲线 | 第47页 |
| 3 测序样品RNA质量分析 | 第47-48页 |
| 4 Solexa文库测序及生物信息学分析 | 第48-63页 |
| 4.1 皮特兰测序结果分析 | 第48-56页 |
| 4.1.1 Solexa文库概述 | 第48页 |
| 4.1.2 Small RNA长度分布 | 第48-49页 |
| 4.1.3 小RNA分类注释 | 第49-50页 |
| 4.1.4 miRNAs的碱基分布特征 | 第50页 |
| 4.1.5 已知miRNA分析 | 第50-51页 |
| 4.1.6 候选miRNA预测 | 第51-52页 |
| 4.1.7 已知miRNA差异分析 | 第52-54页 |
| 4.1.8 miRNA靶基因位点预测 | 第54-55页 |
| 4.1.9 靶基因的功能注释 | 第55-56页 |
| 4.2 清平测序结果分析 | 第56-63页 |
| 4.2.1 Solexa文库概述 | 第56页 |
| 4.2.2 Small RNA长度分布 | 第56-57页 |
| 4.2.3 小RNA分类注释 | 第57-58页 |
| 4.2.4 小RNA与重复序列比对结果 | 第58-59页 |
| 4.2.5 已知miRNA分析 | 第59页 |
| 4.2.6 已知miRNA“种子”区序列碱基编辑 | 第59-60页 |
| 4.2.7 候选miRNA预测 | 第60-61页 |
| 4.2.8 已知miRNA差异表达分析 | 第61-63页 |
| 5 miRNAs实时荧光定量PCR分析验证 | 第63-71页 |
| 5.1 RNA的提取 | 第63页 |
| 5.2 cDNA检测结果 | 第63-64页 |
| 5.3 miRNAs成熟序列的扩增 | 第64页 |
| 5.4 miRNAs的实时定量PCR结果 | 第64-71页 |
| 6 miRNAs在猪中不同组织中的表达结果 | 第71-72页 |
| 7 MX1双荧光素酶报告基因载体的构建结果 | 第72-74页 |
| 7.1 MX1 3'UTR序列的扩增 | 第72页 |
| 7.2 pmirGLO MX1 3'UTR重组质粒的鉴定 | 第72-73页 |
| 7.3 双荧光素酶报告基因的检测结果 | 第73-74页 |
| 第四章 讨论 | 第74-79页 |
| 1 试验样品的选择 | 第74页 |
| 2 检测方法和测序质量 | 第74-75页 |
| 3 miRNA靶基因预测 | 第75-77页 |
| 4 miRNA表达分析 | 第77-79页 |
| 4.1 实时荧光定量PCR检测miRNA | 第77页 |
| 4.2 差异miRNA实时定量验证 | 第77-79页 |
| 第五章 小结 | 第79-80页 |
| 5.1 主要结论 | 第79页 |
| 5.2 下一步工作 | 第79-80页 |
| 参考文献 | 第80-87页 |
| 致谢 | 第87-88页 |
| 附录 | 第88-99页 |
