| 致谢 | 第5-6页 |
| 摘要 | 第6-8页 |
| Abstract | 第8-10页 |
| 缩写符号术语 | 第11-17页 |
| 第一章 绪论 | 第17-30页 |
| 1.1 脱氧核糖醛缩酶 | 第17-20页 |
| 1.1.1 脱氧核糖醛缩酶的性质 | 第17-18页 |
| 1.1.2 脱氧核糖醛缩酶的催化机制 | 第18-20页 |
| 1.2 脱氧核糖醛缩酶的研究进展 | 第20-26页 |
| 1.2.1 脱氧核糖醛缩酶的应用 | 第20-21页 |
| 1.2.2 脱氧核糖醛缩酶高通量筛选方法的研究 | 第21-22页 |
| 1.2.3 新型脱氧核糖醛缩酶的发现 | 第22-23页 |
| 1.2.4 脱氧核糖醛缩酶的改造研究进展 | 第23-25页 |
| 1.2.5 脱氧核糖醛缩酶的固定化研究 | 第25-26页 |
| 1.3 脱氧核糖醛缩酶的应用存在的问题 | 第26页 |
| 1.4 分子动力学模拟 | 第26-28页 |
| 1.4.1 同源建模 | 第26-27页 |
| 1.4.2 分子对接研究 | 第27页 |
| 1.4.3 分子动力学方法 | 第27-28页 |
| 1.4.4 虚拟氨基酸突变 | 第28页 |
| 1.5 本文研究思路 | 第28-30页 |
| 第二章 可见绿色荧光高通量筛选醛缩酶方法的建立 | 第30-44页 |
| 2.1 引言 | 第30-31页 |
| 2.2 材料和方法 | 第31-32页 |
| 2.2.1 主要实验仪器 | 第31页 |
| 2.2.2 主要试剂 | 第31-32页 |
| 2.3 荧光检测原理 | 第32-33页 |
| 2.4 实验方法 | 第33-38页 |
| 2.4.1 可见荧光底物的合成 | 第33-37页 |
| 2.4.2 荧光特征分析 | 第37-38页 |
| 2.4.3 荧光筛选方法的建立 | 第38页 |
| 2.5 结果与讨论 | 第38-42页 |
| 2.5.1 荧光探针作用机理解释 | 第38-39页 |
| 2.5.2 荧光特性分析结果 | 第39-41页 |
| 2.5.3 荧光高通量筛选方法及可靠性评价 | 第41-42页 |
| 2.6 小结 | 第42-44页 |
| 第三章 定向进化改造DERA提高对DR的催化活力 | 第44-65页 |
| 3.1 引言 | 第44页 |
| 3.2 实验仪器和材料 | 第44-46页 |
| 3.2.1 基因序列 | 第44页 |
| 3.2.2 菌种和质粒 | 第44页 |
| 3.2.3 主要实验仪器 | 第44-45页 |
| 3.2.4 主要药品与试剂 | 第45-46页 |
| 3.3 实验方法 | 第46-55页 |
| 3.3.1 培养基与试剂配制 | 第46-47页 |
| 3.3.2 菌种的保藏与活化 | 第47-48页 |
| 3.3.3 DNA引物合成和测序 | 第48页 |
| 3.3.4 质粒的提取 | 第48页 |
| 3.3.5 PCR扩增 | 第48-49页 |
| 3.3.6 酶切 | 第49页 |
| 3.3.7 酶连 | 第49页 |
| 3.3.8 感受态细胞的制备 | 第49页 |
| 3.3.9 转化 | 第49-50页 |
| 3.3.10 诱导 | 第50页 |
| 3.3.11 菌体收集与细胞破碎 | 第50页 |
| 3.3.12 电泳样品的制备 | 第50-51页 |
| 3.3.13 核酸琼脂糖凝胶电泳 | 第51页 |
| 3.3.14 蛋白质SDS-PAGE电泳 | 第51页 |
| 3.3.15 蛋白纯化 | 第51-52页 |
| 3.3.16 蛋白质浓度的测定 | 第52-53页 |
| 3.3.17 脱氧核糖醛缩酶对底物DRP和DR的催化效率比较 | 第53-54页 |
| 3.3.18 脱氧核糖醛缩酶热稳定性的测定 | 第54页 |
| 3.3.19 脱氧核糖醛缩酶乙醛耐受性的测定 | 第54页 |
| 3.3.20 高通量筛选定向进化后的突变库 | 第54-55页 |
| 3.4 结果与讨论 | 第55-64页 |
| 3.4.1 DERA_(Gth)和DERA_(Sep)的蛋白纯化结果 | 第55-56页 |
| 3.4.2 三种重组脱氧核糖醛缩酶对DRP和DR的催化活力 | 第56-60页 |
| 3.4.3 温度对DERA_(Gth)和DERA_(Sep)的影响 | 第60页 |
| 3.4.4 DERA_(Gth)和DERA_(Sep)乙醛耐受性的比较 | 第60-61页 |
| 3.4.5 定向进化构建DERA突变库 | 第61-62页 |
| 3.4.6 高通量筛选脱氧核糖醛缩酶定向进化的结果分析 | 第62-64页 |
| 3.5 小结 | 第64-65页 |
| 第四章 理性改造提高DERA对N-APM的催化活力 | 第65-81页 |
| 4.1 引言 | 第65页 |
| 4.2 实验材料与仪器 | 第65-66页 |
| 4.2.1 本研究所涉及的基因序列 | 第65页 |
| 4.2.2 菌种和质粒 | 第65页 |
| 4.2.3 主要实验仪器和软件 | 第65页 |
| 4.2.4 主要药品与试剂 | 第65-66页 |
| 4.3 实验方法 | 第66-71页 |
| 4.3.1 非天然底物N-丙烯醛邻苯二甲酰亚胺(N-APM)的化学合成 | 第66页 |
| 4.3.2 生物催化反应体系及样品后处理 | 第66-67页 |
| 4.3.3 分析方法 | 第67-68页 |
| 4.3.4 PCR扩增 | 第68-69页 |
| 4.3.5 蛋白质氨基酸序列 | 第69页 |
| 4.3.6 计算结构预测和分子模拟 | 第69页 |
| 4.3.7 同源建模 | 第69-70页 |
| 4.3.8 对接分析 | 第70-71页 |
| 4.3.9 DERA_(Sep)及突变体对N-APM的催化活力的比较 | 第71页 |
| 4.4 结果与讨论 | 第71-79页 |
| 4.4.1 产物分析 | 第71页 |
| 4.4.2 DERA_(Gth),DERA_(Sep)催化N-AMP和乙醛缩合反应活力比较 | 第71-72页 |
| 4.4.3 DERA蛋白结构叙述 | 第72页 |
| 4.4.4 DERA_(Sep)同源建模及模型评价 | 第72-74页 |
| 4.4.5 对接分析和位阻效应分析 | 第74-76页 |
| 4.4.6 突变体的自由结合能计算分析 | 第76-78页 |
| 4.4.7 DERA_(Sep)及三种突变体对底物N-APM的催化活力 | 第78-79页 |
| 4.5 小结 | 第79-81页 |
| 第五章 理性设计提高DERA乙醛耐受性 | 第81-89页 |
| 5.1 引言 | 第81页 |
| 5.2 实验方法 | 第81-83页 |
| 5.2.1 同源建模和模型评价 | 第81页 |
| 5.2.2 虚拟氨基酸突变提高热稳定性 | 第81-82页 |
| 5.2.3 最佳位点定点突变和突变体的蛋白纯化 | 第82-83页 |
| 5.2.4 突变体的热稳定性和乙醛耐受性的测定 | 第83页 |
| 5.2.5 催化底物N-APM和乙醛的缩合反应 | 第83页 |
| 5.3 结果与讨论 | 第83-88页 |
| 5.3.1 脱氧核糖醛缩酶在乙醛中失活机理研究 | 第83-84页 |
| 5.3.2 脱氧核糖醛缩酶DERA_(Sep)虚拟扫描突变突变能的计算 | 第84-85页 |
| 5.3.3 脱氧核糖醛缩酶DERA_(Sep)突变体乙醛耐受性的验证 | 第85-87页 |
| 5.3.4 DERA_(Eco),DERA_(Sep)及突变体催化N-APM的活力比较 | 第87-88页 |
| 5.4 小结 | 第88-89页 |
| 第六章 DERA_(Eco)固定化及酶学性质的考察 | 第89-100页 |
| 6.1 引言 | 第89页 |
| 6.2 材料和方法 | 第89-90页 |
| 6.2.1 主要实验仪器 | 第89页 |
| 6.2.2 主要药品与试剂 | 第89-90页 |
| 6.3 实验方法 | 第90-94页 |
| 6.3.1 磁性纳米载体的制备 | 第90-91页 |
| 6.3.2 纳米磁性DERA的交联体制备 | 第91-92页 |
| 6.3.2.1 酶量和载体量比的影响 | 第91页 |
| 6.3.2.2 交联过程中pH的影响 | 第91页 |
| 6.3.2.3 交联时间的影响 | 第91-92页 |
| 6.3.3 蛋白含量和酶活的测定 | 第92页 |
| 6.3.4 最适pH的测定和酸碱稳定性测定 | 第92-93页 |
| 6.3.5 最适合反应温度和热稳定性的测定 | 第93页 |
| 6.3.6 对底物乙醛耐受性的测定 | 第93页 |
| 6.3.7 重复利用性的测定 | 第93-94页 |
| 6.4 结果与讨论 | 第94-99页 |
| 6.4.1 固定化过程的优化 | 第94-95页 |
| 6.4.1.1 最适酶量和载体量比 | 第94页 |
| 6.4.1.2 最适交联pH | 第94-95页 |
| 6.4.1.3 最适交联时间 | 第95页 |
| 6.4.2 固定化后酶活变化 | 第95-96页 |
| 6.4.3 固定化后酶最适反应pH测定和pH稳定性比较 | 第96-97页 |
| 6.4.4 固定化后酶的最适反应温度测定和热稳定比较 | 第97-98页 |
| 6.4.5 固定化后酶对底物乙醛耐受性 | 第98页 |
| 6.4.6 固定化后酶的重复利用性 | 第98-99页 |
| 6.5 小结 | 第99-100页 |
| 第七章 结论与展望 | 第100-102页 |
| 7.1 结论 | 第100-101页 |
| 7.2 展望 | 第101-102页 |
| 参考文献 | 第102-111页 |
| 附录 | 第111-123页 |
| 附录A 核苷酸序列列表 | 第111-113页 |
| 附录B 氨基酸序列 | 第113-114页 |
| 附录C 引物序列 | 第114-116页 |
| 附录D 质粒图谱 | 第116-118页 |
| 附录E 核磁谱图及ESI质谱图 | 第118-123页 |
| 攻读学位期间的研究成果 | 第123页 |
| 已发表论文 | 第123页 |
| 已授权的专利 | 第123页 |
