| 摘要 | 第3-6页 |
| Abstract | 第6-8页 |
| 英文缩写词表 | 第12-13页 |
| 第1章 绪论 | 第13-23页 |
| 1.1 简述基因组靶向修饰技术 | 第13页 |
| 1.2 CRISPR/Cas9基因组靶向修饰技术的概述 | 第13-15页 |
| 1.3 简述CRISPR/Cas9系统在基因表达调控中的应用 | 第15-16页 |
| 1.4 简述四环素诱导表达调控系统-Tet-on系统 | 第16-18页 |
| 1.5 PGRN分子的研究现状 | 第18-19页 |
| 1.5.1 PGRN的结构与功能 | 第18-19页 |
| 1.5.2 PGRN基因的表达调控 | 第19页 |
| 1.6 课题研究意义 | 第19-20页 |
| 1.7 课题技术路线 | 第20-23页 |
| 1.7.1 Tet-on诱导的靶向PGRN的转录抑制系统的构建及体外实验研究 | 第20页 |
| 1.7.2 PGRN-T2A-Luciferase细胞系的建立、鉴定及体外实验研究 | 第20-21页 |
| 1.7.3 PGRN基因转录抑制受Tet-on诱导的SH-SY5Y细胞系的建立及体外实验研究 | 第21-23页 |
| 第2章 Tet-on诱导的靶向PGRN的转录抑制系统的构建及其体外实验研究 | 第23-56页 |
| 2.1 实验材料 | 第23-30页 |
| 2.1.1 实验菌种、质粒载体及细胞 | 第24页 |
| 2.1.2 主要材料试剂 | 第24-25页 |
| 2.1.3 试剂配制 | 第25-29页 |
| 2.1.4 主要仪器 | 第29-30页 |
| 2.2 实验方法 | 第30-44页 |
| 2.2.1 基于慢病毒载体的Tet-on诱导表达调控系统的构建 | 第31-39页 |
| 2.2.2 基于慢病毒载体的Tet-on诱导表达Cas9m4-KRAB融合蛋白的构建 | 第39-40页 |
| 2.2.3 Western Blot检测Cas9m4-KRAB融合蛋白在真核细胞中的表达 | 第40-42页 |
| 2.2.4 靶向PGRN启动子区的sgRNA的设计、表达载体构建及活性检测 | 第42-43页 |
| 2.2.5 基于慢病毒载体的Tet-on诱导的靶向PGRN的转录抑制系统的构建及检测 | 第43-44页 |
| 2.3 实验结果 | 第44-53页 |
| 2.3.1 携带Tet-on诱导表达调控系统慢病毒载体的鉴定与测试 | 第45-48页 |
| 2.3.2 携带Tet-on诱导表达Cas9m4-KRAB融合蛋白的慢病毒载体的鉴定 | 第48-49页 |
| 2.3.3 靶向PGRN启动子区的sgRNA的筛选 | 第49-51页 |
| 2.3.4 携带Tet-on诱导的靶向PGRN的转录抑制系统慢病毒载体的鉴定与测试 | 第51-53页 |
| 2.4 讨论 | 第53-56页 |
| 第3章 PGRN-T2A-Luciferase Knock-in HEK293及HepG2细胞系的建立及体外研究 | 第56-78页 |
| 3.1 实验材料 | 第56-57页 |
| 3.1.1 实验菌种、质粒载体及细胞 | 第56页 |
| 3.1.2 主要材料试剂 | 第56-57页 |
| 3.1.3 试剂配制 | 第57页 |
| 3.1.4 主要仪器 | 第57页 |
| 3.2 实验方法 | 第57-66页 |
| 3.2.1 靶向PGRN基因启动子下游区域的sgRNA的设计、表达载体的构建与活性检测 | 第57-59页 |
| 3.2.2 靶向PGRN基因的供体载体和打靶载体的构建 | 第59-62页 |
| 3.2.3 利用CRISPR/Cas9技术在PGRN启动子下游定点插入T2A-LuciferaseHEK293和HepG2细胞系的建立 | 第62页 |
| 3.2.4 基于有限稀释法的细胞克隆化 | 第62页 |
| 3.2.5 PCR方法检测外源基因在细胞基因组中的定点整合 | 第62-66页 |
| 3.2.6 荧光素酶报告基因的表达测定 | 第66页 |
| 3.3 实验结果 | 第66-77页 |
| 3.3.1 靶向PGRN基因启动子下游区域的sgRNA的筛选 | 第66-68页 |
| 3.3.2 靶向PGRN基因的供体载体和打靶载体的获得 | 第68-69页 |
| 3.3.3 PGRN-T2A-Luciferase HEK293和HepG2细胞系的建立 | 第69-70页 |
| 3.3.4 PGRN-T2A-Luciferase HEK293和HepG2细胞系的鉴定 | 第70-75页 |
| 3.3.5 Tet-on诱导的转录抑制系统对PGRN-T2A-Luciferase细胞系的中内源性PGRN的转录抑制效率检测 | 第75-77页 |
| 3.4 讨论 | 第77-78页 |
| 第4章 PGRN基因转录抑制受Tet-on诱导的SH-SY5Y细胞系的建立及体外研究 | 第78-84页 |
| 4.1 实验材料 | 第78-79页 |
| 4.1.1 实验细胞 | 第78页 |
| 4.1.2 主要材料试剂 | 第78-79页 |
| 4.1.3 试剂配制 | 第79页 |
| 4.1.4 主要仪器 | 第79页 |
| 4.2 实验方法 | 第79-81页 |
| 4.2.1 建立PGRN基因转录抑制受Tet-on诱导的SH-SY5Y细胞系 | 第79页 |
| 4.2.2 Real-time PCR检测PGRN基因转录抑制受Tet-on诱导的SH-SY5Y细胞系中PGRN的mRNA表达水平 | 第79-81页 |
| 4.2.3 Western Blot检测PGRN基因转录抑制受Tet-on诱导的SH-SY5Y细胞系中PGRN的蛋白表达水平 | 第81页 |
| 4.3 实验结果 | 第81-82页 |
| 4.3.1 Real-time PCR检测所建立的PGRN基因转录抑制受Tet-on诱导的稳定SH-SY5Y细胞系中PGRN mRNA的表达水平 | 第81-82页 |
| 4.3.2 Western Blot检测所建立的PGRN基因转录抑制受Tet-on诱导的稳定SH-SY5Y细胞系中PGRN蛋白的表达水平 | 第82页 |
| 4.4 讨论 | 第82-84页 |
| 第5章 结论 | 第84-85页 |
| 参考文献 | 第85-91页 |
| 附录 | 第91-117页 |
| 致谢 | 第117-119页 |
| 攻读硕士学位期间科研成果 | 第119页 |
