| 摘要 | 第8-9页 |
| Abstract | 第9-10页 |
| 缩略语表 | 第11-15页 |
| 第一章 引言 | 第15-29页 |
| 1 氢能源前景概述 | 第15-18页 |
| 1.1 传统化石能源面临的问题 | 第15页 |
| 1.2 生物炼制的重要性 | 第15-17页 |
| 1.3 生物法制氢的生产方法 | 第17-18页 |
| 1.3.1 热转化制氢 | 第17页 |
| 1.3.2 生物转化制氢 | 第17-18页 |
| 2 发酵生物制氢的研究进展 | 第18-25页 |
| 2.1 发酵制氢菌株及其底物利用能力 | 第18-19页 |
| 2.2 发酵制氢代谢途径 | 第19-21页 |
| 2.2.1 专性厌氧菌产氢途径 | 第19-20页 |
| 2.2.2 兼性厌氧菌产氢途径 | 第20-21页 |
| 2.3 微生物存在的氢酶 | 第21-25页 |
| 2.3.1 发酵制氢过程所涉及的氢酶 | 第21-24页 |
| 2.3.2 NADH氢酶与NADH脱氢酶的关系 | 第24-25页 |
| 3 小RNA RyhB的结构与功能 | 第25-26页 |
| 3.1 小RNA RyhB的结构 | 第25-26页 |
| 3.2 小RNA RyhB的功能 | 第26页 |
| 4 本论文的研究对象产气肠杆菌 | 第26-27页 |
| 5 本课题的研究意义和技术路线 | 第27-29页 |
| 5.1 研究意义与立题思想 | 第27页 |
| 5.2 研究技术路线 | 第27-28页 |
| 5.3 研究内容 | 第28-29页 |
| 第二章 材料与方法 | 第29-45页 |
| 1 材料 | 第29-32页 |
| 1.1 菌株和质粒 | 第29-30页 |
| 1.2 引物 | 第30-31页 |
| 1.3 基因操作实验相关的酶以及试剂盒列表 | 第31页 |
| 1.4 培养基、培养条件及常用试剂的配置 | 第31-32页 |
| 2 实验方法 | 第32-45页 |
| 2.1 质粒提取 | 第32页 |
| 2.2 基因组DNA的小量提取 | 第32-33页 |
| 2.3 琼脂糖凝胶中DNA回收（PCR产物DNA回收） | 第33页 |
| 2.4 基因克隆 | 第33-34页 |
| 2.4.1 引物储存液与工作液的制备 | 第33页 |
| 2.4.2 PCR反应体系的配方 | 第33页 |
| 2.4.3 PCR扩增程序 | 第33-34页 |
| 2.4.4 菌落PCR | 第34页 |
| 2.5 DNA片段的酶切与连接 | 第34-35页 |
| 2.6 DNA片段overlap PCR连接 | 第35页 |
| 2.7 多片段连接及其环化 | 第35页 |
| 2.8 转化 | 第35-37页 |
| 2.8.1 大肠杆菌电激感受态细胞的制备 | 第35-36页 |
| 2.8.2 大肠杆菌电激转化 | 第36页 |
| 2.8.3 大肠杆菌化学感受态细胞的制备 | 第36页 |
| 2.8.4 大肠杆菌CaCl2法转化 | 第36-37页 |
| 2.9 琼脂糖凝胶电泳分析 | 第37页 |
| 2.10 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE） | 第37-38页 |
| 2.11 RNA提取及Northern Bolt | 第38-40页 |
| 2.11.1 基因组RNA提取 | 第38页 |
| 2.11.2 Northern转膜 | 第38-40页 |
| 2.12 发酵液中葡萄糖含量的测定 | 第40-41页 |
| 2.13 氢酶酶活的检测方法 | 第41-42页 |
| 2.13.1 LDH、ADH和BDDH酶活的测定 | 第41-42页 |
| 2.14 基于CRISPER-CAS9基因整合技术 | 第42-45页 |
| 2.14.1 CRISPER-CAS9基因整合技术操作步骤 | 第43-45页 |
| 第三章 敲除菌株及质粒的构建 | 第45-55页 |
| 1 构建基因工程菌株IAM1183-CD和IAM1183-CDE | 第45-48页 |
| 1.1 引言 | 第45页 |
| 1.2 敲除菌株和引物 | 第45-47页 |
| 1.3 敲除结果 | 第47-48页 |
| 1.3.1 IAM1183-CD敲除结果 | 第47-48页 |
| 2 构建外源表达小RNA RyhB表达载体 | 第48-51页 |
| 2.1 引言 | 第48页 |
| 2.2 菌株和质粒 | 第48-50页 |
| 2.2.1 携带有氯霉素抗性RyhB表达载体的构建 | 第49-50页 |
| 2.3 Northern Bolt验证 | 第50-51页 |
| 3 构建外源表达Nad合成酶表达载体 | 第51-53页 |
| 3.1 引言 | 第51-52页 |
| 3.2 Nad合成酶表达载体的构建 | 第52页 |
| 3.3 SDS-PAGE验证 | 第52-53页 |
| 4 小结与讨论 | 第53-55页 |
| 第四章 基因工程菌株功能检测及发酵产氢结果 | 第55-71页 |
| 1 各菌株生长曲线和pH | 第55-57页 |
| 2 各菌株血清瓶批式发酵产氢量及代谢产物含量 | 第57-64页 |
| 2.1 测定发酵液中有机酸和醇类的含量 | 第58-61页 |
| 2.2 发酵液中葡萄糖含量的测定 | 第61-62页 |
| 2.3 结果与分析 | 第62-64页 |
| 3 各菌株产氢代谢途径和氢酶酶活分析 | 第64-67页 |
| 3.1 各菌株甲酸途径与NADH产氢途径分析 | 第64-66页 |
| 3.2 各菌株NADH依赖型氢酶酶活分析 | 第66-67页 |
| 4 发酵罐发酵制氢 | 第67-69页 |
| 5 小结与讨论 | 第69-71页 |
| 第五章 总结 | 第71-73页 |
| 参考文献 | 第73-79页 |
| 攻读硕士学位期间的研究成果 | 第79-80页 |
| 致谢 | 第80页 |
