| 摘要 | 第4-8页 |
| ABSTRACT | 第8-12页 |
| 第一章 前言 | 第17-30页 |
| 1.1 燃料酒精 | 第17-18页 |
| 1.2 宏基因组研究 | 第18-23页 |
| 1.2.1 微生物资源 | 第18页 |
| 1.2.2 未培养微生物 | 第18-20页 |
| 1.2.3 未培养微生物的研究方法 | 第20页 |
| 1.2.4 宏基因组的研究 | 第20-23页 |
| 1.3 β-葡萄糖苷酶 | 第23-28页 |
| 1.3.1 β-葡萄糖苷酶的分类 | 第23-24页 |
| 1.3.2 β-葡萄糖苷酶的分子结构和催化机制 | 第24-25页 |
| 1.3.3 β-葡萄糖苷酶的研究进展 | 第25-27页 |
| 1.3.4 β-葡萄糖苷酶的应用 | 第27-28页 |
| 1.4 蔗糖酶 | 第28-29页 |
| 1.5 本课题研究的目的和意义 | 第29-30页 |
| 第二章 材料与方法 | 第30-51页 |
| 2.1 材料 | 第30-31页 |
| 2.1.1 菌株与质粒 | 第30页 |
| 2.1.2 主要酶制剂和化学试剂 | 第30页 |
| 2.1.3 PCR引物及DNA测序 | 第30页 |
| 2.1.4 主要仪器设备 | 第30-31页 |
| 2.1.5 培养基和溶液配制 | 第31页 |
| 2.2 方法与步骤 | 第31-51页 |
| 2.2.1 土样的采集 | 第31页 |
| 2.2.2 菌种保藏 | 第31页 |
| 2.2.3 细菌基因组总DNA的提取 | 第31-32页 |
| 2.2.4 小量质粒DNA提取 | 第32页 |
| 2.2.5 DNA酶切与连接 | 第32页 |
| 2.2.6 CaCl_2法制备大肠杆菌感受态细胞和转化 | 第32页 |
| 2.2.7 电透析洗脱法回收DNA片段 | 第32-33页 |
| 2.2.8 SDS-PAGE蛋白质电泳 | 第33页 |
| 2.2.9 蛋白质浓度测定 | 第33-34页 |
| 2.2.10 金属镍亲和层析柱纯化目的蛋白 | 第34页 |
| 2.2.11 高糖土壤宏基因组DNA提取 | 第34-35页 |
| 2.2.12 高糖土壤宏基因组DNA的纯化 | 第35页 |
| 2.2.13 高糖土壤细菌16S rDNA基因文库构建及系统发育分析 | 第35-36页 |
| 2.2.14 Fosmid文库的构建 | 第36-38页 |
| 2.2.15 高糖土壤基因组文库的筛选 | 第38页 |
| 2.2.16 重组Fosmid质粒的亚克隆及序列分析 | 第38-39页 |
| 2.2.17 基因的表达与蛋白质产物的纯化 | 第39-44页 |
| 2.2.18 蔗糖转化酶的酶学特性的测定 | 第44-46页 |
| 2.2.19 β-葡萄糖苷酶酶的酶学特性的测定 | 第46-48页 |
| 2.2.20 β-葡萄糖苷酶Unbgl3A定点饱和突变 | 第48-51页 |
| 第三章 结果与分析 | 第51-110页 |
| 3.1 宏基因组Fosmid文库的构建和新型酶基因筛选 | 第51-57页 |
| 3.1.1 高糖土壤宏基因DNA提取和纯化 | 第51-52页 |
| 3.1.2 高糖土壤细菌多样性分析 | 第52-53页 |
| 3.1.3 高糖土壤宏基因组文库构建及质量评价 | 第53-54页 |
| 3.1.4 和糖类水解相关酶活性克隆的筛选 | 第54-57页 |
| 3.2 高效表达的酸性β-葡萄糖苷酶-Unbgl3A | 第57-72页 |
| 3.2.1 unbgl3A基因的生物信息学分析 | 第57-60页 |
| 3.2.2 unbgl3A基因的克隆和表达 | 第60-62页 |
| 3.2.3 Unbgl3A的酶学特性研究 | 第62-70页 |
| 3.2.4 Unbgl3A β-葡萄糖苷酶基因的分子改造 | 第70-72页 |
| 3.3 高耐受酒精的β-葡萄糖苷酶-Unbgl3B | 第72-87页 |
| 3.3.1 unbgl3B对基因的生物信息学分析 | 第72-78页 |
| 3.3.2 unbgl3B基因的克隆和表达 | 第78-80页 |
| 3.3.3 Unbgl3B的酶学特性分析 | 第80-87页 |
| 3.4 高耐受葡萄糖的β-葡萄糖苷酶-Unbgl1A | 第87-102页 |
| 3.4.1 unbgl1A基因的生物信息学分析 | 第87-91页 |
| 3.4.2 unbgl1A基因的克隆和表达 | 第91-94页 |
| 3.4.3 Unbgl1A的酶学特性分析 | 第94-102页 |
| 3.5 中性蔗糖转化酶-Uminv4 | 第102-110页 |
| 3.5.1 uminv4基因的生物信息学分析 | 第102-105页 |
| 3.5.2 uminv4基因的克隆、表达 | 第105-107页 |
| 3.5.3 Uminv4的酶学特性研究 | 第107-110页 |
| 第四章 讨论 | 第110-117页 |
| 4.1 高糖土壤宏基因组DNA提取与纯化 | 第110-111页 |
| 4.2 高效表达的酸性β-葡萄糖苷酶-Unbgl3A | 第111-112页 |
| 4.2.1 Unbgl3A是一个被多种单糖和双糖激活的β-葡萄糖苷酶 | 第111页 |
| 4.2.2 Unbgl3A具有中温条件下热稳定的特性 | 第111页 |
| 4.2.3 Unbgl3A不是金属酶 | 第111-112页 |
| 4.2.4 Unbgl3A在大肠杆菌得到高效表达 | 第112页 |
| 4.3 高耐受酒精的β-葡萄糖苷酶-Unbgl3B | 第112-114页 |
| 4.3.1 Unbgl3B是一个新的β-葡萄糖苷酶 | 第112-113页 |
| 4.3.2 Unbgl3B是一个水解作用温和的β-葡萄糖苷酶 | 第113页 |
| 4.3.3 Unbgl3B具有耐受酒精的优良特性 | 第113-114页 |
| 4.4 高耐受葡萄糖的β-葡萄糖苷酶-Unbgl1A | 第114-116页 |
| 4.4.1 Unbgl1A是一个具有强的抗葡萄糖抑制的β-葡萄糖苷酶 | 第114-115页 |
| 4.4.2 Unbgl1A拥有一个高的酶活力和底物亲和力 | 第115页 |
| 4.4.3 Unbgl1A具有较强的转糖苷作用 | 第115-116页 |
| 4.4.4 Unbgl1A具有较强的耐受NaCl的能力 | 第116页 |
| 4.5 Uminv4是一个能水解菊糖的蔗糖转化酶 | 第116-117页 |
| 第五章 结论和展望 | 第117-121页 |
| 5.1 结论 | 第117-119页 |
| 5.1.1 高糖土壤未培养微生物宏基因组的构建、筛选和多样性分析 | 第117页 |
| 5.1.2 Unbgl3A的克隆表达、酶学特性和生物信息学研究 | 第117-118页 |
| 5.1.3 Unbgl3B的克隆表达、酶学特性和生物信息学研究 | 第118页 |
| 5.1.4 Unbgl1A克隆表达、酶学特性和生物信息学研究 | 第118-119页 |
| 5.1.5 Uminv4克隆表达、酶学特性和生物信息学研究 | 第119页 |
| 5.2 展望 | 第119-121页 |
| 参考文献 | 第121-138页 |
| 附录1 | 第138-142页 |
| 附录2 | 第142-144页 |
| 致谢 | 第144-145页 |
| 攻读学位期间所发表的学术论文和研究成果 | 第145页 |
