| 摘要 | 第7-9页 |
| Abstract | 第9-10页 |
| 缩略语表 | 第11-13页 |
| 1 文献综述 | 第13-23页 |
| 1.1 弓形虫综述 | 第13-16页 |
| 1.1.1 弓形虫与弓形虫病 | 第13页 |
| 1.1.2 弓形虫的生活史 | 第13-14页 |
| 1.1.3 弓形虫的入侵机制 | 第14-16页 |
| 1.2 钙离子信号通路简介 | 第16-20页 |
| 1.2.1 钙离子信号通路概述 | 第16-17页 |
| 1.2.2 钙离子信号通路在弓形虫各生长阶段的作用 | 第17-18页 |
| 1.2.3 钙离子相关蛋白在弓形虫生长过程中的作用 | 第18-20页 |
| 1.3 生物素标记技术在蛋白组学中的应用 | 第20-21页 |
| 1.3.1 生物素标记技术简介 | 第20页 |
| 1.3.2 生物素标记技术的应用 | 第20-21页 |
| 1.4 Cre-Lox P重组系统与CRISPR/Cas9技术 | 第21-23页 |
| 1.4.1 Cre-LoxP重组系统 | 第21页 |
| 1.4.2 CRISPR/Cas9技术 | 第21-23页 |
| 2 研究目的与意义 | 第23-24页 |
| 3 材料与方法 | 第24-44页 |
| 3.1 实验材料 | 第24-26页 |
| 3.1.1 实验动物 | 第24页 |
| 3.1.2 实验菌株、虫株与细胞 | 第24页 |
| 3.1.3 载体与质粒 | 第24-25页 |
| 3.1.4 引物 | 第25-26页 |
| 3.2 主要仪器与试剂 | 第26-29页 |
| 3.2.1 主要仪器 | 第26页 |
| 3.2.2 主要试剂盒 | 第26页 |
| 3.2.3 主要试剂 | 第26-27页 |
| 3.2.4 主要溶液的配制 | 第27-29页 |
| 3.3 实验方法 | 第29-44页 |
| 3.3.1 弓形虫的体外培养 | 第29页 |
| 3.3.2 弓形虫基因组DNA的提取 | 第29-30页 |
| 3.3.3 弓形虫RNA的提取 | 第30页 |
| 3.3.4 弓形虫cDNA的制备 | 第30-31页 |
| 3.3.5 基因敲除相关质粒的构建 | 第31-34页 |
| 3.3.6 重组蛋白的原核表达 | 第34页 |
| 3.3.7 GST融合蛋白的纯化 | 第34-37页 |
| 3.3.8 CaM敲除株的构建及鉴定 | 第37-38页 |
| 3.3.9 CaM条件性敲除质粒的构建和鉴定 | 第38-39页 |
| 3.3.10 间接荧光免疫 (IFA) | 第39-40页 |
| 3.3.11 复制实验 | 第40页 |
| 3.3.12 入侵实验 | 第40-41页 |
| 3.3.13 生物素标记实验 | 第41-42页 |
| 3.3.14 Western blot | 第42-44页 |
| 4 结果与分析 | 第44-62页 |
| 4.1 弓形虫CaM蛋白原核表达、蛋白纯化和多克隆抗体的制备 | 第44-47页 |
| 4.1.1 CaM蛋白的原核表达 | 第44页 |
| 4.1.2 pGEX-KG-CaM原核表达质粒的构建 | 第44-45页 |
| 4.1.3 CaM蛋白的原核表达 | 第45-46页 |
| 4.1.4 CaM蛋白的纯化 | 第46-47页 |
| 4.1.5 CaM多克隆抗体的制备 | 第47页 |
| 4.2 RH△HX△CaM敲除虫株的构建 | 第47-51页 |
| 4.2.1.pUC19-DHFR质粒的构建 | 第47-50页 |
| 4.2.2 CaM基因敲除虫株的构建 | 第50页 |
| 4.2.3 CaM基因敲除虫株的鉴定 | 第50-51页 |
| 4.3 CaM条件性敲除虫株的构建 | 第51-57页 |
| 4.3.1 pDONR-G265::CaM质粒的构建 | 第51-53页 |
| 4.3.2 pUC19-CaM-YFP质粒的构建 | 第53页 |
| 4.3.3 RH△HX-LoxP-CaM虫株的构建 | 第53-54页 |
| 4.3.4 CaM基因的条件性敲除 | 第54-55页 |
| 4.3.5 CaM条件性敲除虫株的鉴定 | 第55-56页 |
| 4.3.6 CaM条件性敲除虫株的入侵实验 | 第56-57页 |
| 4.3.7 CaM条件性敲除虫株的复制实验 | 第57页 |
| 4.4 BioID生物素标记技术筛选CaM的互作蛋白 | 第57-62页 |
| 4.4.1 pBirA*-CaM质粒的构建 | 第57-58页 |
| 4.4.2 pBirA*-CaM质粒的鉴定 | 第58-59页 |
| 4.4.3 RH△HX-BirA*-CaM虫株的构建 | 第59页 |
| 4.4.4 Western-blot检测生物素标记蛋白 | 第59-60页 |
| 4.4.5 质谱分析CaM的互作蛋白 | 第60-62页 |
| 5 讨论 | 第62-66页 |
| 5.1 弓形虫CaM蛋白的原核表达以及多克隆抗体 | 第62页 |
| 5.2 弓形虫CaM基因的敲除及表型研究 | 第62-63页 |
| 5.3 利用BioID技术筛选互作蛋白 | 第63-66页 |
| 6 结论 | 第66-67页 |
| 参考文献 | 第67-75页 |
| 致谢 | 第75-77页 |
| 附录A | 第77-81页 |
| 附录B | 第81页 |
