| 摘要 | 第8-10页 |
| ABSTRACT | 第10-11页 |
| 缩略语表 | 第12-13页 |
| 1.前言 | 第13-25页 |
| 1.1 酯酶简介 | 第13-16页 |
| 1.1.1 酯酶的结构 | 第13-14页 |
| 1.1.2 酯酶的催化机制 | 第14-16页 |
| 1.2 酯酶的来源及产酯酶微生物的筛选 | 第16页 |
| 1.2.1 酯酶的来源 | 第16页 |
| 1.2.2 产酯酶微生物的筛选 | 第16页 |
| 1.3 酯酶酶活的鉴定 | 第16-17页 |
| 1.3.1 平板法 | 第16-17页 |
| 1.3.2 pH测定法 | 第17页 |
| 1.3.3 光谱法 | 第17页 |
| 1.4 酯酶的应用 | 第17-20页 |
| 1.4.1 医药工业 | 第17-18页 |
| 1.4.2 洗涤剂工业 | 第18页 |
| 1.4.3 纺织工业 | 第18-19页 |
| 1.4.4 造纸工业 | 第19页 |
| 1.4.5 食品工业 | 第19页 |
| 1.4.6 化妆品 | 第19-20页 |
| 1.5 冷活性酶 | 第20-21页 |
| 1.5.1 冷活性酶的来源 | 第20页 |
| 1.5.2 冷活性酶分子结构特点 | 第20-21页 |
| 1.5.3 冷活性酶的应用 | 第21页 |
| 1.6 蛋白质工程概述 | 第21-24页 |
| 1.6.1 蛋白工程理性设计（protein rational design） | 第23-24页 |
| 1.6.2 随机突变（random mutagenesis） | 第24页 |
| 1.7 本研究的目的和意义 | 第24-25页 |
| 2 材料与方法 | 第25-42页 |
| 2.1 材料 | 第25-28页 |
| 2.1.1 菌株与质粒 | 第25页 |
| 2.1.2 实验试剂 | 第25-26页 |
| 2.1.3 培养基 | 第26-27页 |
| 2.1.4 溶液 | 第27-28页 |
| 2.1.5 仪器设备 | 第28页 |
| 2.2 产酯酶菌株筛选与鉴定 | 第28-30页 |
| 2.2.1 产酯酶菌株的筛选 | 第28-29页 |
| 2.2.2 产酯酶菌株的 16S rRNA鉴定 | 第29-30页 |
| 2.3 酯酶重组质粒构建 | 第30-32页 |
| 2.3.1 酯酶基因的克隆 | 第30-31页 |
| 2.3.2 大肠杆菌感受态制备 | 第31-32页 |
| 2.3.3 电转化 | 第32页 |
| 2.3.4 阳性克隆子检测 | 第32页 |
| 2.4 酯酶EstA的表达和纯化 | 第32-35页 |
| 2.4.1 酯酶基因的诱导表达及纯化 | 第32-33页 |
| 2.4.2 目标蛋白SDS-PAGE检测 | 第33-34页 |
| 2.4.3 蛋白质浓度测定 | 第34-35页 |
| 2.5 酯酶EstA的酶学性质研究 | 第35-37页 |
| 2.5.1 对硝基苯酚标准曲线绘制 | 第35页 |
| 2.5.2 酯酶酶学性质检测方法 | 第35-36页 |
| 2.5.3 酯酶EstA底物特异性测定 | 第36页 |
| 2.5.4 酯酶EstA最适反应pH测定 | 第36页 |
| 2.5.5 酯酶EstA最适反应温度测定 | 第36页 |
| 2.5.6 酯酶EstA热稳定性测定 | 第36页 |
| 2.5.7 酯酶EstA pH值稳定性测定 | 第36页 |
| 2.5.8 高浓度NaCl溶液对酯酶活性和稳定性的影响 | 第36-37页 |
| 2.5.9 不同去污剂对酯酶活性的影响 | 第37页 |
| 2.5.10 不同有机溶剂对酯酶活性的影响 | 第37页 |
| 2.5.11 酯酶酶动力学常数研究 | 第37页 |
| 2.5.12 酯酶三维结构模拟和分析 | 第37页 |
| 2.6 est A随机突变文库的构建 | 第37-40页 |
| 2.6.1 易错PCR扩增estA | 第37页 |
| 2.6.2 易错PCR产物的纯化、酶切及回收 | 第37-38页 |
| 2.6.3 目的片段与载体酶连及转化 | 第38页 |
| 2.6.4 文库构建质量检测 | 第38页 |
| 2.6.5 基于96孔板的高通量酯酶随机突变文库的筛选 | 第38-39页 |
| 2.6.6 突变体蛋白的诱导表达及纯化 | 第39-40页 |
| 2.6.7 突变体A92P的基本酶学性质测定 | 第40页 |
| 2.6.8 突变体A92P的酶动力学常数测定 | 第40页 |
| 2.6.9 突变体A92P的三维空间结构模拟 | 第40页 |
| 2.7 酯酶92位点的饱和突变研究 | 第40-42页 |
| 2.7.1 饱和突变引物设计 | 第40-41页 |
| 2.7.2 环状PCR法扩增目的片段 | 第41-42页 |
| 2.7.3 突变体电转化及验证 | 第42页 |
| 2.7.4 酯酶92位点饱和突变株诱导表达和热稳定性初步检测 | 第42页 |
| 2.7.5 突变体大量诱导表达和纯化 | 第42页 |
| 2.7.6 突变体热稳定性测定 | 第42页 |
| 3 结果与分析 | 第42-60页 |
| 3.1 产酯酶菌株筛选结果 | 第42页 |
| 3.2 基因组总DNA抽提 | 第42-43页 |
| 3.3 菌株 16s鉴定 | 第43-44页 |
| 3.4 PCR扩增estA基因 | 第44页 |
| 3.5 重组质粒pGEX-6p-estA的构建 | 第44-45页 |
| 3.6 克隆子测序及分析 | 第45-46页 |
| 3.7 酯酶蛋白的表达和纯化 | 第46-47页 |
| 3.8 EstA的酶学性质检测 | 第47-52页 |
| 3.8.1 对硝基苯酚标准曲线 | 第47-48页 |
| 3.8.2 底物对EstA活性的影响 | 第48页 |
| 3.8.3 温度对酯酶EstA活性和热稳定性的影响 | 第48-49页 |
| 3.8.4 不同的pH对酯酶EstA活性和稳定性的影响 | 第49-50页 |
| 3.8.5 不同浓度钠盐对酯酶EstA活性和稳定性的影响 | 第50-51页 |
| 3.8.6 有机溶剂对酯酶EstA活性的影响 | 第51页 |
| 3.8.7 去污剂对酯酶EstA活性的影响 | 第51-52页 |
| 3.8.8 酯酶动力学常数 | 第52页 |
| 3.9 est A基因随机突变和饱和突变研究 | 第52-60页 |
| 3.9.1 易错PCR法扩增基因片段 | 第52-53页 |
| 3.9.2 随机突变库构建及检测 | 第53-54页 |
| 3.9.3 突变体筛选 | 第54-55页 |
| 3.9.4 环状PCR定点突变扩增 | 第55页 |
| 3.9.5 突变子的热稳定性检测 | 第55页 |
| 3.9.6 热稳定提高突变体表达和纯化 | 第55-56页 |
| 3.9.7 温度和pH值对突变体酶活的影响 | 第56-57页 |
| 3.9.8 温度对突变体热稳定性的影响 | 第57-58页 |
| 3.9.9 突变体的动力学常数分析 | 第58-59页 |
| 3.9.10 3D结构模拟 | 第59-60页 |
| 4 讨论 | 第60-64页 |
| 4.1 酯酶EstA酶学性质分析 | 第60-61页 |
| 4.2 酯酶EstA的冷活性分析 | 第61-62页 |
| 4.3 随机突变及定点突变改良酯酶热稳定性分析 | 第62-64页 |
| 参考文献 | 第64-70页 |
| 附录 | 第70-71页 |
| 致谢 | 第71页 |
