| 摘要 | 第8-10页 |
| Abstract | 第10-11页 |
| 缩略语表（Abbreviations） | 第12-13页 |
| 1 前言 | 第13-21页 |
| 1.1 谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase，GS） | 第13页 |
| 1.2 微生物谷氨酰胺合成酶的结构和作用机制 | 第13-15页 |
| 1.2.1 微生物谷氨酰胺合成酶的结构 | 第13-14页 |
| 1.2.2 微生物谷氨酰胺合成酶的作用机制 | 第14-15页 |
| 1.3 谷氨酰胺合成酶的研究热点 | 第15-16页 |
| 1.4 谷氨酰胺合成酶的应用 | 第16-19页 |
| 1.4.1 利用谷氨酰胺合成酶合成谷氨酰胺 | 第16-17页 |
| 1.4.2 谷氨酰胺合成酶在转基因植物方面的应用 | 第17-18页 |
| 1.4.3 谷氨酰胺合成酶催化合成茶氨酸 | 第18-19页 |
| 1.5 常用的蛋白质的改造策略 | 第19-20页 |
| 1.5.1 蛋白质的定向进化 | 第19页 |
| 1.5.2 蛋白质的理性设计 | 第19-20页 |
| 1.6 研究的目的和意义 | 第20-21页 |
| 2 材料和方法 | 第21-44页 |
| 2.1 材料 | 第21-27页 |
| 2.1.1 质粒与菌株 | 第21-22页 |
| 2.1.2 试剂 | 第22页 |
| 2.1.3 培养基 | 第22页 |
| 2.1.4 实验相关溶液 | 第22-25页 |
| 2.1.5 仪器设备 | 第25-26页 |
| 2.1.6 PCR引物 | 第26-27页 |
| 2.2 BGS基因的获得方法 | 第27-32页 |
| 2.2.1 含GS的菌株的筛选 | 第27页 |
| 2.2.2 GS转移酶活性测定 | 第27页 |
| 2.2.3 BGS基因的克隆 | 第27-29页 |
| 2.2.3.1 细菌基因组DNA的提取 | 第27-28页 |
| 2.2.3.2 扩增 16SrDNA序列 | 第28页 |
| 2.2.3.3 PCR扩增BGS基因 | 第28-29页 |
| 2.2.4 PCR产物纯化、回收与酶切 | 第29-30页 |
| 2.2.5 快速抽提细菌的质粒DNA | 第30页 |
| 2.2.6 碱裂解抽提细菌的质粒DNA | 第30-31页 |
| 2.2.7 构建pGEX-6p-BGS重组表达载体 | 第31页 |
| 2.2.8 大肠杆菌感受态的制备 | 第31页 |
| 2.2.9 电转化 | 第31-32页 |
| 2.2.10 检测阳性克隆子 | 第32页 |
| 2.3 BGS的表达与纯化 | 第32-35页 |
| 2.3.1 感受态的制备 | 第32页 |
| 2.3.2 BGS的诱导表达 | 第32-33页 |
| 2.3.3 SDS-PAGE凝胶的配制 | 第33-34页 |
| 2.3.4 BGS蛋白的纯化 | 第34页 |
| 2.3.5 蛋白浓度测定 | 第34-35页 |
| 2.4 BGS的酶学性质 | 第35-37页 |
| 2.4.1 标准曲线的绘制 | 第35页 |
| 2.4.2 BGS的最适反应温度 | 第35-36页 |
| 2.4.3 谷氨酰胺合成酶的最适pH | 第36页 |
| 2.4.4 BGS的温度耐受 | 第36页 |
| 2.4.5 BGS的pH耐受 | 第36页 |
| 2.4.6 金属离子和不同化学试剂对BGS的影响 | 第36页 |
| 2.4.7 酶动力学性质的测定 | 第36-37页 |
| 2.5 BGS的突变体的构建 | 第37-42页 |
| 2.5.1 随机突变文库的构建 | 第37-38页 |
| 2.5.1.1 易错PCR扩增BGS基因 | 第37页 |
| 2.5.1.2 易错PCR产物的纯化、酶切与回收 | 第37-38页 |
| 2.5.1.3 pGEX-6p-1 重组载体的构建 | 第38页 |
| 2.5.1.4 突变库插入率的检测 | 第38页 |
| 2.5.1.5 随机突变文库的筛选 | 第38页 |
| 2.5.2 定点突变突变位点的设计 | 第38-39页 |
| 2.5.2.1 BGS的蛋白质多序列比对 | 第38-39页 |
| 2.5.2.2 BGS的同源建模与分子对接 | 第39页 |
| 2.5.3 定点突变引物的设计 | 第39-40页 |
| 2.5.4 突变体的构建 | 第40-41页 |
| 2.5.5 突变体菌株的表达与活性检测 | 第41页 |
| 2.5.6 突变体的蛋白的纯化与浓度测定 | 第41页 |
| 2.5.7 突变体的酶学性质测定 | 第41-42页 |
| 2.6 野生型与突变体BGS产茶氨酸的定性与定量 | 第42-43页 |
| 2.6.1 BGS产茶氨酸的定性 | 第42页 |
| 2.6.2 BGS产茶氨酸的定量 | 第42-43页 |
| 2.6.2.1 茶氨酸标曲 | 第42页 |
| 2.6.2.2 茶氨酸的定量 | 第42-43页 |
| 2.7 突变体蛋白的结构模拟与分析 | 第43-44页 |
| 3 结果与分析 | 第44-71页 |
| 3.1 筛选目标菌株 | 第44页 |
| 3.2 目的基因的克隆 | 第44-47页 |
| 3.2.1 总DNA的提取 | 第44页 |
| 3.2.2 目标菌株的菌种鉴定 | 第44-45页 |
| 3.2.3 扩增BGS | 第45-46页 |
| 3.2.4 构建重组质粒 | 第46-47页 |
| 3.3 BGS的表达和纯化 | 第47-48页 |
| 3.4 BGS的酶学性质分析 | 第48-53页 |
| 3.4.1 产物标准曲线的绘制 | 第48-49页 |
| 3.4.2 最适温度和温度耐受的测定 | 第49-50页 |
| 3.4.3 最适pH和pH耐受的测定 | 第50-51页 |
| 3.4.4 金属离子对BGS活性的影响 | 第51-52页 |
| 3.4.5 化学试剂对BGS活性的影响 | 第52页 |
| 3.4.6 BGS酶动力学常数的测定 | 第52-53页 |
| 3.4.7 BGS产茶氨酸的验证 | 第53页 |
| 3.5 突变体的获得 | 第53-67页 |
| 3.5.1 随机突变 | 第53-56页 |
| 3.5.1.1 易错PCR的结果 | 第54页 |
| 3.5.1.2 插入率检测 | 第54-55页 |
| 3.5.1.3 突变情况检测 | 第55-56页 |
| 3.5.1.4 筛选结果 | 第56页 |
| 3.5.2 定点突变 | 第56-57页 |
| 3.5.2.1 选择突变位点 | 第56-57页 |
| 3.5.2.2 突变体的构建 | 第57页 |
| 3.5.2.3 表达与检测突变体的活性 | 第57页 |
| 3.5.3 复合突变与回复突变 | 第57-58页 |
| 3.5.4 突变体蛋白的纯化 | 第58-59页 |
| 3.5.5 突变体酶学性质的研究 | 第59-67页 |
| 3.5.5.1 最适温度与温度耐受 | 第60页 |
| 3.5.5.2 最适pH和pH稳定性 | 第60-61页 |
| 3.5.5.3 金属离子对突变体活性的影响 | 第61-63页 |
| 3.5.5.4 化学试剂对突变体活性的影响 | 第63-65页 |
| 3.5.5.5 所有突变体酶动力学常数的测定 | 第65-67页 |
| 3.6 野生型和突变体茶氨酸产量的测定 | 第67-69页 |
| 3.6.1 茶氨酸标曲 | 第67-68页 |
| 3.6.2 酵母联合发酵茶氨酸的产量 | 第68-69页 |
| 3.7 突变体蛋白的结构模拟结果 | 第69-71页 |
| 4 总结与讨论 | 第71-73页 |
| 4.1 野生型与突变体酶学性质的变化 | 第71页 |
| 4.2 突变体酶学性质变化的结构模拟分析 | 第71-73页 |
| 参考文献 | 第73-78页 |
| 附录 | 第78-79页 |
| 致谢 | 第79页 |
