| 摘要 | 第8-10页 |
| ABSTRACT | 第10-11页 |
| 缩略语表 | 第12-13页 |
| 1.前言 | 第13-24页 |
| 1.1 海藻糖 | 第13-15页 |
| 1.1.1 海藻糖概述 | 第13页 |
| 1.1.2 海藻糖在自然界中的分布 | 第13-14页 |
| 1.1.3 海藻糖的代谢途径 | 第14页 |
| 1.1.4 海藻糖的作用 | 第14-15页 |
| 1.1.4.1 为生命活动提供能量 | 第14页 |
| 1.1.4.2 保护细胞不受外界不利刺激的伤害 | 第14-15页 |
| 1.1.4.3 作为生长调节剂 | 第15页 |
| 1.1.4.4 作为细菌细胞壁的组分 | 第15页 |
| 1.2 海藻糖酶 | 第15-22页 |
| 1.2.1 海藻糖酶简介 | 第15页 |
| 1.2.2 海藻糖酶分类 | 第15-17页 |
| 1.2.3 海藻糖酶分解海藻糖的机制 | 第17-18页 |
| 1.2.4 海藻糖酶的作用 | 第18-21页 |
| 1.2.4.1 海藻糖酶在昆虫中的作用 | 第18-19页 |
| 1.2.4.2 海藻糖酶在植物中的作用 | 第19-20页 |
| 1.2.4.3 海藻糖酶在真菌中的作用 | 第20-21页 |
| 1.2.4.4 海藻糖酶在高等动物体内的作用 | 第21页 |
| 1.2.5 海藻糖酶的应用 | 第21-22页 |
| 1.2.5.1 海藻糖酶在昆虫防治中的应用 | 第21页 |
| 1.2.5.2 海藻糖酶在临床上的应用 | 第21-22页 |
| 1.2.5.3 海藻糖酶在食物中的应用 | 第22页 |
| 1.3 本研究的目的及意义 | 第22-23页 |
| 1.4 技术路线 | 第23-24页 |
| 2.材料与方法 | 第24-42页 |
| 2.1 材料 | 第24-27页 |
| 2.1.1 菌株与质粒 | 第24页 |
| 2.1.2 试剂 | 第24页 |
| 2.1.3 培养基 | 第24-25页 |
| 2.1.4 溶液 | 第25-26页 |
| 2.1.5 仪器设备 | 第26-27页 |
| 2.2 海藻糖酶基因的获得方法 | 第27-31页 |
| 2.2.1 阴沟肠杆菌Enterobacter Cloacae基因组DNA的抽提 | 第27页 |
| 2.2.2 克隆海藻糖酶基因 | 第27-28页 |
| 2.2.3 PCR产物的纯化、回收与酶切 | 第28-29页 |
| 2.2.4 碱裂解法抽提大肠杆菌pGEX-6p-1 的质粒 | 第29-30页 |
| 2.2.5 pGEX-6p-1 载体的制备 | 第30页 |
| 2.2.6 酶连 | 第30页 |
| 2.2.7 大肠杆菌电转化感受态的制备 | 第30-31页 |
| 2.2.8 电转化 | 第31页 |
| 2.2.9 阳性克隆子的检测 | 第31页 |
| 2.3 海藻糖酶的表达与纯化 | 第31-34页 |
| 2.3.1 感受态的制备 | 第31页 |
| 2.3.2 海藻糖酶基因的诱导表达 | 第31-32页 |
| 2.3.3 海藻糖酶蛋白的SDS-PAGE凝胶检测 | 第32-33页 |
| 2.3.4 海藻糖酶蛋白的纯化 | 第33-34页 |
| 2.3.5 蛋白浓度测定 | 第34页 |
| 2.4 海藻糖酶的酶学性质研究 | 第34-37页 |
| 2.4.1 葡萄糖标准曲线的绘制 | 第34-35页 |
| 2.4.2 海藻糖酶的酶活测定方法 | 第35-36页 |
| 2.4.3 海藻糖酶最适反应温度的测定 | 第36页 |
| 2.4.4 海藻糖酶热稳定性的测定 | 第36页 |
| 2.4.5 海藻糖酶最适pH的测定 | 第36-37页 |
| 2.4.6 海藻糖酶pH稳定性的测定 | 第37页 |
| 2.4.7 不同金属离子对海藻糖酶影响的测定 | 第37页 |
| 2.4.8 海藻糖酶酶动力学常数的测定 | 第37页 |
| 2.5 海藻糖酶基因随机突变体库的构建 | 第37-40页 |
| 2.5.1 易错PCR扩增海藻糖酶基因 | 第37-38页 |
| 2.5.2 易错PCR产物的纯化、回收与酶切 | 第38页 |
| 2.5.3 酶连 | 第38页 |
| 2.5.4 电转化 | 第38页 |
| 2.5.5 随机突变库的质量检测 | 第38-39页 |
| 2.5.6 随机突变库的筛选 | 第39页 |
| 2.5.7 突变体蛋白的诱导表达和纯化 | 第39页 |
| 2.5.8 突变体蛋白的酶学性质测定 | 第39页 |
| 2.5.9 突变体蛋白的酶动力学常数测定 | 第39-40页 |
| 2.6 海藻糖酶的定点突变研究 | 第40-42页 |
| 2.6.1 定点突变引物的设计 | 第40-41页 |
| 2.6.1.1 随机突变体定点回复突变引物的设计 | 第40页 |
| 2.6.1.2 基于海藻糖酶三维结构模拟的定点突变引物的设计 | 第40-41页 |
| 2.6.2 定点突变的过程 | 第41-42页 |
| 2.6.3 定点突变体蛋白的表达和纯化 | 第42页 |
| 2.6.4 定点突变体蛋白的酶学性质测定 | 第42页 |
| 2.7 酶的三维结构的模拟 | 第42页 |
| 3.结果与分析 | 第42-64页 |
| 3.1 海藻糖酶treE重组质粒的构建及其基因序列分析 | 第42-45页 |
| 3.2 treE蛋白的表达纯化 | 第45-46页 |
| 3.3 海藻糖酶treE的酶学性质分析 | 第46-49页 |
| 3.3.1 葡萄糖标准曲线的绘制 | 第46页 |
| 3.3.2 海藻糖酶treE的最适反应温度和温度稳定性 | 第46页 |
| 3.3.3 海藻糖酶treE的最适反应pH和pH稳定性 | 第46-47页 |
| 3.3.4 不同金属离子对海藻糖酶treE活性的影响 | 第47-48页 |
| 3.3.5 treE酶动力学参数的测定 | 第48-49页 |
| 3.4 海藻糖酶基因随机突变库的构建 | 第49-55页 |
| 3.4.1 易错PCR法扩增treE基因 | 第49页 |
| 3.4.2 treE随机突变体库质量的检测 | 第49-50页 |
| 3.4.3 突变体库突变频率的检测 | 第50-51页 |
| 3.4.4 活性提高突变株的筛选 | 第51-52页 |
| 3.4.5 随机突变体酶 1-D8的诱导表达及纯化 | 第52-53页 |
| 3.4.6 随机突变体酶 1-D8的酶学性质的分析 | 第53-55页 |
| 3.4.6.1 随机突变体酶 1-D8的最适反应温度和温度稳定性 | 第53页 |
| 3.4.6.2 随机突变体酶 1-D8的最适反应pH和p H稳定性 | 第53-54页 |
| 3.4.6.3 随机突变体酶 1-D8的酶动力学常数分析 | 第54-55页 |
| 3.5 treE定点突变分析 | 第55-64页 |
| 3.5.1 随机突变体 1-D8的定点回复突变 | 第55-61页 |
| 3.5.1.1 1-D8定点回复突变质粒的获得 | 第55-57页 |
| 3.5.1.2 1-D8定点回复突变酶的诱导表达 | 第57-58页 |
| 3.5.1.3 1-D8定点回复突变酶的最适温度和温度稳定性 | 第58-59页 |
| 3.5.1.4 1-D8定点回复突变酶的最适pH和pH稳定性 | 第59-60页 |
| 3.5.1.5 1-D8定点回复突变酶的酶动力学常数分析 | 第60-61页 |
| 3.5.2 基于海藻糖酶treE三维结构模拟的定点突变 | 第61-64页 |
| 3.5.2.1 定点突变质粒的获得 | 第61-62页 |
| 3.5.2.2 定点突变酶的诱导表达与纯化 | 第62-63页 |
| 3.5.2.3 定点突变酶的反应最适温度和最适pH的测定 | 第63-64页 |
| 3.5.2.4 定点突变体酶的酶动力学常数分析 | 第64页 |
| 4.讨论 | 第64-69页 |
| 4.1 野生型酶treE的酶学性质分析 | 第64-65页 |
| 4.2 随机突变体 1-D8及其回复突变酶学性质分析 | 第65-67页 |
| 4.3 定点突变体R168G酶学性质分析 | 第67-69页 |
| 参考文献 | 第69-75页 |
| 研究成果 | 第75-76页 |
| 致谢 | 第76页 |
