| 摘要 | 第5-7页 |
| Abstract | 第7-8页 |
| 第1章 前言 | 第12-22页 |
| 1.1 手性环氧化物及其邻位二醇 | 第12-15页 |
| 1.1.1 环氧化物的简介 | 第12页 |
| 1.1.2 手性环氧化物及其邻位二醇的合成 | 第12-15页 |
| 1.2 环氧化物水解酶 | 第15-17页 |
| 1.2.1 α/β-环氧水解酶家族酶的结构 | 第16页 |
| 1.2.2 α/β-环氧水解酶家族的催化机制 | 第16-17页 |
| 1.3 环氧水解酶的应用研究 | 第17-20页 |
| 1.3.1 环氧水解酶的药物靶点作用 | 第17页 |
| 1.3.2 环氧水解酶的催化应用 | 第17-19页 |
| 1.3.3 环氧水解酶的结构解析 | 第19-20页 |
| 1.4 环氧水解酶的蛋白质工程改造 | 第20-21页 |
| 1.5 本课题的研究意义及思路 | 第21-22页 |
| 第2章 环氧水解酶VrEH2的生化性质 | 第22-35页 |
| 2.1 前言 | 第22页 |
| 2.2 实验材料和设备 | 第22-24页 |
| 2.2.1 实验仪器 | 第22-23页 |
| 2.2.2 材料 | 第23页 |
| 2.2.3 药品及溶液的配制 | 第23-24页 |
| 2.3 实验方法 | 第24-27页 |
| 2.3.1 大肠杆菌感受态的制备 | 第24-25页 |
| 2.3.2 标准底物对硝基苯乙烯氧化物(pNSO)的合成及其拆分 | 第25页 |
| 2.3.3 重组绿豆环氧水解酶VrEH2的发酵 | 第25页 |
| 2.3.4 蛋白纯化 | 第25-26页 |
| 2.3.5 蛋白浓度测定 | 第26页 |
| 2.3.6 酶活测定 | 第26页 |
| 2.3.7 温度、pH、稳定性对酶活的影响 | 第26-27页 |
| 2.3.8 助溶剂对选择性的影响 | 第27页 |
| 2.3.9 动力学参数的测定 | 第27页 |
| 2.3.10 立体选择性测定 | 第27页 |
| 2.4 结果与讨论 | 第27-34页 |
| 2.4.1 pNSO的合成及光学纯产品的拆分 | 第27-28页 |
| 2.4.2 VrEH2的发酵 | 第28页 |
| 2.4.3 蛋白纯化 | 第28-30页 |
| 2.4.4 测定酶活 | 第30页 |
| 2.4.5 pH以及温度对酶活的影响 | 第30-32页 |
| 2.4.6 助溶剂对酶活力的影响 | 第32-33页 |
| 2.4.7 动力学参数的测定 | 第33页 |
| 2.4.8 VrEH2位置选择性的测定 | 第33-34页 |
| 2.5 本章总结 | 第34-35页 |
| 第3章 化学-酶法催化制备光学纯(R)-pNPG | 第35-45页 |
| 3.1 引言 | 第35页 |
| 3.2 实验材料与方法 | 第35-36页 |
| 3.2.1 主要试剂 | 第35页 |
| 3.2.2 实验设备 | 第35页 |
| 3.2.3 实验方法 | 第35-36页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第36-44页 |
| 3.3.1 酶法或酸法催化水解光学纯pNSO | 第36-38页 |
| 3.3.2 酸浓度对选择性的影响 | 第38-39页 |
| 3.3.3 酶法/化学-酶法催化水解研究 | 第39-42页 |
| 3.3.4 反应优化放大 | 第42页 |
| 3.3.5 化学-酶法组合制备(R)-pNPG | 第42-44页 |
| 3.4 本章总结 | 第44-45页 |
| 第4章 绿豆环氧水解酶底物谱的研究 | 第45-57页 |
| 4.1 前言 | 第45页 |
| 4.2 实验材料与方法 | 第45-48页 |
| 4.2.1 底物 | 第45-46页 |
| 4.2.2 材料设备 | 第46页 |
| 4.2.3 检测条件 | 第46-47页 |
| 4.2.4 VrEH2以及VrEH1酶活测定 | 第47页 |
| 4.2.5 VrEH2以及VrEH1选择性的测定 | 第47页 |
| 4.2.6 有机溶剂及表面活性剂对酶活力的影响 | 第47页 |
| 4.2.7 反应体系的优化 | 第47页 |
| 4.2.8 (R)-8a的制备 | 第47-48页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第48-55页 |
| 4.3.1 标准曲线 | 第48-50页 |
| 4.3.2 VrEH2和VrEH1活性比较 | 第50页 |
| 4.3.3 VrEH2和VrEH1选择性的比较 | 第50-52页 |
| 4.3.4 表面活性剂及有机溶剂对选择性的影响 | 第52-53页 |
| 4.3.5 底物与酶量的优化 | 第53-55页 |
| 4.3.6 (R)-8a的制备 | 第55页 |
| 4.4 本章总结 | 第55-57页 |
| 第5章 绿豆环氧水解酶VrEH2分子改造的初步探索 | 第57-68页 |
| 5.1 前言 | 第57页 |
| 5.2 实验材料与方法 | 第57-59页 |
| 5.2.1 主要试剂 | 第57页 |
| 5.2.2 主要仪器 | 第57页 |
| 5.2.3 引物序列 | 第57-58页 |
| 5.2.4 定点突变PCR扩增体系 | 第58-59页 |
| 5.2.5 转化 | 第59页 |
| 5.2.6 同源建模 | 第59页 |
| 5.2.7 突变热点的选取(丙氨酸扫描) | 第59页 |
| 5.3 结果与讨论 | 第59-66页 |
| 5.3.1 序列比对 | 第59-60页 |
| 5.3.2 VrEH2突变体M1(G3E/V4I)的制备与纯化 | 第60-62页 |
| 5.3.3 VrEH2突变体M1的酶学性质表征 | 第62-64页 |
| 5.3.4 VrEH2突变体M1的动力学表观参数 | 第64页 |
| 5.3.5 丙氨酸扫描 | 第64-66页 |
| 5.4 本章小结 | 第66-68页 |
| 全文总结与展望 | 第68-71页 |
| 参考文献 | 第71-78页 |
| 附录 | 第78-80页 |
| 攻读硕士期间论文发表情况 | 第80-81页 |
| 致谢 | 第81页 |
