| 致谢 | 第4-5页 |
| 摘要 | 第5-6页 |
| Abstract | 第6页 |
| 主要缩略词表 | 第7-12页 |
| 第一章 研究背景 | 第12-38页 |
| 1.1 小RNA病毒 | 第12-15页 |
| 1.1.1 小RNA病毒科病毒的基因组结构 | 第12-13页 |
| 1.1.2 小RNA病毒的生活周期 | 第13-15页 |
| 1.2 EV71病毒研究现状 | 第15-23页 |
| 1.2.1 EV71概述 | 第15页 |
| 1.2.2 EV71蛋白质组学研究进展 | 第15-23页 |
| 1.3 RdRP（3D）简介 | 第23-27页 |
| 1.3.1 聚合酶的生物活性 | 第23-25页 |
| 1.3.2 依赖RNA的RNA聚合酶的结构 | 第25-26页 |
| 1.3.3 依赖RNA的RNA聚合酶的N端结构 | 第26-27页 |
| 1.4 小RNA病毒聚合酶的与RNA的延伸复合物 | 第27-32页 |
| 1.4.1 PV复合物的结构特征 | 第28-29页 |
| 1.4.2 RdRP延伸催化循环 | 第29-30页 |
| 1.4.3 聚合酶活性中心关闭构象 | 第30-32页 |
| 1.5 小RNA病毒聚合酶的保真度研究 | 第32-34页 |
| 1.5.1 聚合酶活性中心口袋 | 第32-33页 |
| 1.5.2 N端结合口袋 | 第33页 |
| 1.5.3 基序A与聚合酶保真度 | 第33-34页 |
| 1.5.4 基序D与聚合酶的保真度 | 第34页 |
| 1.6 转位的相关研究 | 第34-36页 |
| 1.7 本课题的研究意义 | 第36-38页 |
| 第二章 实验材料与实验方法 | 第38-60页 |
| 本章简介 | 第38-39页 |
| 2.1 EV71-SK-3D~(pol)原核表达载体的构建 | 第39-41页 |
| 2.1.1 引物设计 | 第39页 |
| 2.1.2 PCR（聚合酶链反应）扩增目的片段 | 第39-40页 |
| 2.1.3 含有黏性模板的模板提取 | 第40页 |
| 2.1.4 酶切载体 | 第40页 |
| 2.1.5 酶连体系 | 第40-41页 |
| 2.1.6 质粒的转化和挑选克隆 | 第41页 |
| 2.1.7 酶切鉴定 | 第41页 |
| 2.2 SK-C291M突变体载体构建构建 | 第41-43页 |
| 2.2.1 QuickChange原理以及引物设计 | 第41-42页 |
| 2.2.2 PCR扩增出突变序列 | 第42页 |
| 2.2.3 酶切原始载体 | 第42页 |
| 2.2.4 质粒的转化和挑选克隆 | 第42页 |
| 2.2.5 测序鉴定 | 第42-43页 |
| 2.3 EV71-SK-3D蛋白表达 | 第43-46页 |
| 2.3.1 分析蛋白序列 | 第43页 |
| 2.3.2 表达载体的转化 | 第43页 |
| 2.3.3 病毒聚合酶大规模诱导 | 第43-44页 |
| 2.3.4 SDS-PAGE检测蛋白表达量 | 第44页 |
| 2.3.5 菌种破碎 | 第44页 |
| 2.3.6 EV71-SK-3D的纯化 | 第44-45页 |
| 2.3.7 蛋白浓度测定 | 第45-46页 |
| 2.3.8 蛋白的纯化效果鉴定 | 第46页 |
| 2.4 RNA制备 | 第46-51页 |
| 2.4.1 RNA制备原理 | 第46-47页 |
| 2.4.2 RNA_V5-5 引物模板设计 | 第47页 |
| 2.4.3 PCR反应 | 第47-48页 |
| 2.4.4 体外转录 | 第48-49页 |
| 2.4.5 体外自剪切 | 第49页 |
| 2.4.6 小胶检测RNA转录与剪切效果 | 第49页 |
| 2.4.7 尿素聚丙烯酰胺胶纯化RNA | 第49-50页 |
| 2.4.8 EluTrap纯化RNA | 第50页 |
| 2.4.9 乙醇沉淀 | 第50页 |
| 2.4.10 RNA含量测定以及保存 | 第50-51页 |
| 2.5 复合物的组装与纯化 | 第51-53页 |
| 2.5.1 RNA_V5-5+P10组装 | 第51页 |
| 2.5.2 聚合酶复合物活性测试 | 第51页 |
| 2.5.3 聚合酶RNA复合物大规模组装 | 第51-52页 |
| 2.5.4 聚合酶RNA复合物纯化 | 第52页 |
| 2.5.5 超滤浓缩以及置换溶液 | 第52页 |
| 2.5.6 复合物浓度测定 | 第52页 |
| 2.5.7 复合物稳定性测试 | 第52-53页 |
| 2.6 复合物筛选晶体 | 第53-54页 |
| 2.6.1 蛋白质晶体生长原理 | 第53页 |
| 2.6.2 蛋白质结晶条件的筛选 | 第53页 |
| 2.6.3 复合物晶体的重复及优化 | 第53-54页 |
| 2.7 浸泡实验 | 第54-55页 |
| 2.7.1 配置浸泡溶液 | 第54页 |
| 2.7.2 浸泡操作 | 第54页 |
| 2.7.3 浸泡策略 | 第54-55页 |
| 2.8 数据处理 | 第55-57页 |
| 2.8.1 X射线晶体学的发展 | 第55页 |
| 2.8.2 晶体的空间群 | 第55页 |
| 2.8.3 数据收集 | 第55-56页 |
| 2.8.4 结构解析 | 第56-57页 |
| 2.9 部分溶液的配方 | 第57-60页 |
| 2.9.1 病毒蛋白纯化溶液 | 第57-58页 |
| 2.9.2 聚合酶与RNA复合物纯化溶液 | 第58-59页 |
| 2.9.3 其他溶液 | 第59-60页 |
| 第三章 实验结果与讨论 | 第60-92页 |
| 3.1 EV71聚合酶复合物的结晶与结构解析 | 第60-76页 |
| 3.1.1 分子克隆结果 | 第60-62页 |
| 3.1.2 突变体结果 | 第62页 |
| 3.1.3 表达纯化结果分析 | 第62-63页 |
| 3.1.4 AKTA纯化EV71-S K-3D蛋白 | 第63-66页 |
| 3.1.5 RNA_V5-5 的制备 | 第66-68页 |
| 3.1.6 SK-RNA_V5-5 复合物的制备 | 第68-71页 |
| 3.1.7 EV71-SK-RNA_V5-5 晶体筛选与优化 | 第71-75页 |
| 3.1.8 EV71-SK-C291M-RNA_V5-5 晶体的筛选与浸泡 | 第75-76页 |
| 3.2 RNA 病毒聚合酶核苷酸添加循环机制研究 | 第76-92页 |
| 3.2.1 EV71-SK-3D-RNA_V5-5 复合物结构特征 | 第76-78页 |
| 3.2.2 NTP结合的起始阶段 | 第78-79页 |
| 3.2.3 NTP结合的过程 | 第79-81页 |
| 3.2.4 聚合酶活性中心的关闭和催化反应 | 第81-83页 |
| 3.2.5 模板正一位为A时的活性中心口袋 | 第83-84页 |
| 3.2.6 模板正一位为A时的关闭构象 | 第84-87页 |
| 3.2.7 转位中间体 | 第87-89页 |
| 3.2.8 C291M-RNA_V5-5 浸泡结果分析 | 第89-92页 |
| 第四章 总结与展望 | 第92-96页 |
| 参考文献 | 第96-106页 |
| 作者简历 | 第106-107页 |
