| 摘要 | 第3-4页 |
| Abstract | 第4-5页 |
| 第一章 绪论 | 第9-16页 |
| 1.1 巴斯德毕赤酵母表达系统 | 第9-10页 |
| 1.1.1 巴斯德毕赤酵母表达系统简介 | 第9页 |
| 1.1.2 影响外源基因高效表达的因素 | 第9-10页 |
| 1.2 普鲁兰酶的研究进展 | 第10-13页 |
| 1.2.1 普鲁兰酶生产菌株 | 第11-12页 |
| 1.2.2 普鲁兰酶异源表达 | 第12-13页 |
| 1.3 普鲁兰酶的工业应用 | 第13-14页 |
| 1.3.1 普鲁兰酶在淀粉食品生产中的应用 | 第13页 |
| 1.3.2 普鲁兰酶在酿造工业中的应用 | 第13-14页 |
| 1.3.3 普鲁兰酶在高麦芽糖浆生产中的应用 | 第14页 |
| 1.3.4 普鲁兰酶在高葡萄糖浆生产中的应用 | 第14页 |
| 1.4 立题意义与研究内容 | 第14-16页 |
| 第二章 材料与方法 | 第16-23页 |
| 2.1 材料 | 第16-18页 |
| 2.1.1 菌株和质粒 | 第16页 |
| 2.1.2 引物 | 第16页 |
| 2.1.3 酶和试剂 | 第16-17页 |
| 2.1.4 仪器设备 | 第17页 |
| 2.1.5 主要培养基 | 第17-18页 |
| 2.2 方法 | 第18-23页 |
| 2.2.1 普鲁兰酶基因的设计和合成 | 第18页 |
| 2.2.2 目的基因的扩增 | 第18页 |
| 2.2.3 质粒的构建 | 第18-19页 |
| 2.2.4 巴斯德毕赤酵母感受态的制备与转化 | 第19页 |
| 2.2.5 巴斯德毕赤酵母高拷贝菌株筛选 | 第19页 |
| 2.2.6 重组巴斯德毕赤酵母的诱导表达 | 第19页 |
| 2.2.7 DNA Shuffling基因改组 | 第19页 |
| 2.2.8 改组基因的筛选 | 第19页 |
| 2.2.9 巴斯德毕赤酵母尿嘧啶缺陷型突变株的筛选 | 第19页 |
| 2.2.10 淀粉酶高产菌株的筛选 | 第19-20页 |
| 2.2.11 标记基因的剔除 | 第20页 |
| 2.2.12 菌体生物量测定 | 第20页 |
| 2.2.13 淀粉酶酶活测定 | 第20页 |
| 2.2.14 普鲁兰酶酶活测定 | 第20-21页 |
| 2.2.15 目的蛋白分离纯化 | 第21页 |
| 2.2.16 蛋白浓度检测 | 第21页 |
| 2.2.17 酶学性质的测定 | 第21-22页 |
| 2.2.18 重组巴斯德毕赤酵母的发酵优化 | 第22-23页 |
| 第三章 结果与分析 | 第23-56页 |
| 3.1 来源于Bacillus deramificans和Bacillus naganoensis的普鲁兰酶基因在巴斯德毕赤酵母中的表达与重组酶性质分析 | 第23-26页 |
| 3.1.1 表达载体pPIC9K-BdP8和pPIC9K-BnP2的构建 | 第23-24页 |
| 3.1.2 普鲁兰酶编码基因BdP8和BnP2在巴斯德毕赤酵母中的表达 | 第24页 |
| 3.1.3 重组普鲁兰酶Bd P8和BnP2的纯化与酶学性质 | 第24-26页 |
| 3.2 嵌合体基因WXP03的获得 | 第26-31页 |
| 3.2.1 普鲁兰酶编码基因Bd P8和Bn P2的分子改组 | 第27-28页 |
| 3.2.2 筛选重组酶的可裂解大肠杆菌表达载体与筛选方法的确定 | 第28-29页 |
| 3.2.3 性能改善的嵌合体基因的筛选 | 第29-31页 |
| 3.3 普鲁兰酶嵌合体WXP03在巴斯德毕赤酵母中的表达与重组酶性质分析 | 第31-34页 |
| 3.3.1 普鲁兰酶嵌合体WXP03在巴斯德毕赤酵母中的表达 | 第31-32页 |
| 3.3.2 重组普鲁兰酶WXP03的纯化 | 第32-33页 |
| 3.3.3 重组普鲁兰酶WXP03的酶学性质分析 | 第33-34页 |
| 3.4 来源于B. deramificans的普鲁兰酶基因突变体BdP4在毕赤酵母中的表达与重组酶性质分析 | 第34-38页 |
| 3.4.1 普鲁兰酶基因突变体BdP4在巴斯德毕赤酵母中的表达 | 第35页 |
| 3.4.2 重组普鲁兰酶Bd P4的纯化 | 第35-36页 |
| 3.4.3 重组普鲁兰酶Bd P4的酶学性质分析 | 第36-38页 |
| 3.5 诱变提高普鲁兰酶基因WXP03在巴斯德毕赤酵母中表达 | 第38-48页 |
| 3.5.1 巴斯德毕赤酵母尿嘧啶营养缺陷型的获得 | 第39-40页 |
| 3.5.2 构建在AOX启动子控制下分泌表达淀粉酶基因SfA的重组质粒 | 第40-44页 |
| 3.5.3 重组酵母P. pastoris GS115/pPIC9K-SfA-TT-PpURA3-RP的构建与筛选 | 第44-45页 |
| 3.5.4 诱变与高表达普鲁兰酶基因WXP03的突变株的筛选 | 第45-46页 |
| 3.5.5 标记基因的剔除 | 第46-47页 |
| 3.5.6 PpURA3基因的回补 | 第47-48页 |
| 3.6 二次转化WXP03基因高表达菌株筛选 | 第48-49页 |
| 3.7 重组酵母P. pastoris GS115/pPIC9K-WXP03 WBB359的摇瓶发酵优化 | 第49-53页 |
| 3.7.1 重组巴斯德毕赤酵母在不同碳源下的生长曲线 | 第49-50页 |
| 3.7.2 重组巴斯德毕赤酵母在不同浓度碳源下的生长曲线 | 第50页 |
| 3.7.3 诱导起始时间对产普鲁兰酶的影响 | 第50-51页 |
| 3.7.4 初始菌浓对产普鲁兰酶的影响 | 第51-52页 |
| 3.7.5 诱导甲醇浓度对产普鲁兰酶的影响 | 第52页 |
| 3.7.6 诱导初始pH对产普鲁兰酶的影响 | 第52-53页 |
| 3.8 重组巴斯德毕赤酵母的 5 L发酵罐发酵条件的初始优化 | 第53-56页 |
| 3.8.1 发酵pH对产普鲁兰酶的影响 | 第53-54页 |
| 3.8.2 甲醇诱导时机对产普鲁兰酶的影响 | 第54页 |
| 3.8.3 甲醇流加量对产普鲁兰酶的影响 | 第54-55页 |
| 3.8.4 重组巴斯德毕赤酵母的产酶进程比较 | 第55-56页 |
| 主要结论与展望 | 第56-58页 |
| 主要结论 | 第56-57页 |
| 展望 | 第57-58页 |
| 致谢 | 第58-59页 |
| 参考文献 | 第59-62页 |
| 附录A: 作者在攻读硕士学位期间发表的论文 | 第62-63页 |
| 附录B: 经密码子优化后的基因序列 | 第63-67页 |
| 附录C: 普鲁兰酶氨基酸序列比对结果 | 第67页 |
