| 摘要 | 第9-10页 |
| 前言 | 第10-11页 |
| 文献综述 | 第11-18页 |
| 1 毛囊的形成发育过程 | 第11-12页 |
| 1.1 毛囊形成过程 | 第11页 |
| 1.2 毛囊发育过程中的调控因子 | 第11-12页 |
| 2 EDA在动物毛发生长过程中的调控作用 | 第12-15页 |
| 2.1 EDA信号通路 | 第12-13页 |
| 2.2 EDA的信号通路与动物毛发生长发育 | 第13-15页 |
| 3 MicroRNA在动物皮肤毛发中的调控作用 | 第15-16页 |
| 3.1 MicroRNA概述 | 第15-16页 |
| 3.2 MicroRNA与动物皮肤毛发的生长发育 | 第16页 |
| 4 研究意义和目的 | 第16-18页 |
| 实验一 EDA基因在羊驼耳部、背部皮肤的表达差异分析 | 第18-22页 |
| 1 材料 | 第18页 |
| 1.1 实验动物和材料 | 第18页 |
| 1.2 主要的仪器设备 | 第18页 |
| 1.3 试剂、耗材 | 第18页 |
| 2 方法 | 第18-19页 |
| 2.1 提取羊驼皮肤的总RNA | 第18页 |
| 2.2 反转录合成cDNA | 第18-19页 |
| 2.3 PCR引物设计及扩增 | 第19页 |
| 2.4 实时荧光定量PCR | 第19页 |
| 3 结果 | 第19-21页 |
| 3.1 EDA基因扩增及序列比对 | 第19-20页 |
| 3.2 羊驼耳部和背部皮肤EDA mRNA表达差异 | 第20-21页 |
| 4 小结 | 第21-22页 |
| 实验二 EDA在羊驼耳部、背部皮肤中的定位分析 | 第22-26页 |
| 1 材料 | 第22页 |
| 1.1 实验材料 | 第22页 |
| 1.2 主要的仪器设备 | 第22页 |
| 1.3 试剂、耗材 | 第22页 |
| 2 方法 | 第22-23页 |
| 2.1 制备石蜡切片 | 第22页 |
| 2.1.1 组织修块 | 第22页 |
| 2.1.2 脱水与透明 | 第22页 |
| 2.1.3 组织的浸蜡 | 第22页 |
| 2.1.4 组织的包埋 | 第22页 |
| 2.1.5 组织的切片 | 第22页 |
| 2.2 免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC) | 第22-23页 |
| 2.3 图像采集与数据分析 | 第23页 |
| 3 结果 | 第23-25页 |
| 3.1 IHC结果 | 第23-25页 |
| 4 小结 | 第25-26页 |
| 实验三 EDA蛋白在羊驼耳部和背部皮肤中差异表达分析 | 第26-30页 |
| 1 材料 | 第26页 |
| 1.1 实验动物和材料 | 第26页 |
| 1.2 主要的仪器设备 | 第26页 |
| 1.3 试剂、耗材 | 第26页 |
| 2 方法 | 第26-28页 |
| 2.1 提取羊驼皮肤总蛋白 | 第26页 |
| 2.2 蛋白免疫印迹(Western blot) | 第26-27页 |
| 2.2.1 蛋白样品制备 | 第26页 |
| 2.2.2 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第26-27页 |
| 2.2.3 转膜及抗体孵育 | 第27页 |
| 2.3 Western blot的结果分析 | 第27-28页 |
| 3 结果 | 第28-29页 |
| 4 小结 | 第29-30页 |
| 实验四 构建EDA双荧光报告载体 | 第30-36页 |
| 1 材料 | 第30页 |
| 1.1 实验材料 | 第30页 |
| 1.2 主要试剂与仪器 | 第30页 |
| 1.2.1 主要的仪器设备 | 第30页 |
| 1.2.2 试剂、耗材 | 第30页 |
| 2 方法 | 第30-33页 |
| 2.1 EDA基因3'-UTR的双荧光素报告载体的构建 | 第30-31页 |
| 2.1.1 EDA基因3'-UTR部分片段的扩增及克隆 | 第30-31页 |
| 2.1.2 靶基因与双荧光素报告载体的双酶切及连接 | 第31页 |
| 2.2 293T细胞的培养及细胞的转染 | 第31-33页 |
| 2.2.1 菌液的无内毒素质粒的提取 | 第31-32页 |
| 2.2.2 293T细胞的培养 | 第32页 |
| 2.2.3 质粒共转染细胞及检测荧光素的变化 | 第32-33页 |
| 3 结果 | 第33-35页 |
| 3.1 靶基因EDA 3'-UTR的扩增,克隆及双酶切 | 第33页 |
| 3.2 EDA 3'-UTR双荧光报告载体的构建 | 第33-34页 |
| 3.3 双荧光报告载体验证EDA与let-7b的靶向关系 | 第34-35页 |
| 4 小结 | 第35-36页 |
| 实验五 细胞水平检测let-7b对EDA的表达调控 | 第36-41页 |
| 1 材料 | 第36页 |
| 1.1 实验材料 | 第36页 |
| 1.2 主要的仪器设备 | 第36页 |
| 1.3 试剂、耗材 | 第36页 |
| 2 方法 | 第36-37页 |
| 2.1 羊驼皮肤成纤维细胞的培养 | 第36-37页 |
| 2.1.1 羊驼皮肤成纤维细胞的复苏 | 第36页 |
| 2.1.2 羊驼皮肤成纤维细胞的传代培养 | 第36-37页 |
| 2.2 let-7b真核表达载体转染羊驼皮肤成纤维细胞 | 第37页 |
| 2.3 提取羊驼皮肤成纤维细胞总RNA和总蛋白 | 第37页 |
| 2.3.1 提取羊驼皮肤成纤维细胞总RNA和反转录cDNA | 第37页 |
| 2.3.2 提取羊驼皮肤成纤维细胞总蛋白 | 第37页 |
| 2.4 实时荧光定量PCR检测转染后EDA mRNA表达水平 | 第37页 |
| 2.5 蛋白免疫印迹(Western blot)检测转染后EDA蛋白表达水平 | 第37页 |
| 3 结果 | 第37-40页 |
| 3.1 let-7b转染羊驼成纤维细胞的效率 | 第37-38页 |
| 3.2 实时荧光定量PCR结果 | 第38-39页 |
| 3.3 蛋白免疫印迹(Western blot)结果 | 第39-40页 |
| 4 小结 | 第40-41页 |
| 实验六 细胞免疫化学分析转染let-7b真核过表达载体后EDA的定位 | 第41-45页 |
| 1 材料 | 第41页 |
| 1.1 实验材料 | 第41页 |
| 1.2 主要的仪器设备 | 第41页 |
| 1.3 试剂、耗材 | 第41页 |
| 2 方法 | 第41-42页 |
| 2.1 羊驼皮肤成纤维细胞的培养及爬片 | 第41页 |
| 2.1.1 制作玻璃爬片 | 第41页 |
| 2.1.2 羊驼皮肤成纤维细胞的培养 | 第41页 |
| 2.2 let-7b真核过表达载体转染细胞 | 第41-42页 |
| 2.3 细胞免疫化学实验 | 第42页 |
| 2.4 图像的采集 | 第42页 |
| 3 结果 | 第42-44页 |
| 4 小结 | 第44-45页 |
| 讨论 | 第45-47页 |
| 1 EDA对羊驼毛发生长的的影响 | 第45页 |
| 2 let-7b与EDA靶向关系的验证 | 第45-46页 |
| 3 let-7b对EDA的调控关系 | 第46-47页 |
| 结论 | 第47-48页 |
| 参考文献 | 第48-55页 |
| Abstract | 第55-56页 |
| 附录 | 第57-59页 |
| 致谢 | 第59页 |
